UPLC和HPLC法檢測豬肉中磺胺類藥物殘留的比較

羅成江，陳慧華，林仙軍，韋敏玨，周 煒，應永飛

(浙江省獸藥監察所，杭州 310020)

超高效液相色譜(UPLC)技術是近年來發展較快的新型液相色譜檢測技術，采用了2.0 μm以下顆粒度的色譜柱填料，能夠獲得更高的柱效，并且在更寬的線速度范圍內柱效保持恒定，因而有利于提高流動相流速、縮短分析時間和提高分析通量。相對于傳統HPLC而言，UPLC具有更好的分離效率、峰容量以及靈敏度，為復雜體系的分離分析提供了良好的技術平臺[1]。

磺胺類藥物(Sulfonamides，SAs)是具有對氨基苯磺酰胺結構的一類藥物的總稱，是常用的廣譜抗菌藥。因其具有抗菌譜廣、高效、低毒和價格低廉等特點，在動物養殖中被廣泛使用。人類經常食用有磺胺類藥物殘留的動物源性食品，可能引起磺胺類藥物在體內的逐漸累積.其危害性主要表現為細菌耐藥性、過敏、造血紊亂、致癌作用以及激素樣作用等[2-3]。目前中國、歐盟、美國、日本等均將磺胺類藥物列為動物飼養過程中限制使用的藥物。其最大殘留限量一般為50～100 μg/kg。本文采用農牧發[2001]38號動物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測方法[4]，分別在UPLC儀器和HPLC儀器上同時對磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺喹惡啉(SQ)5種磺胺在豬肉中的殘留量測定，并比較2種方法測定結果。結果表明HPLC分析方法能夠成功地轉換并優化為UPLC方法，既達到了樣品分析的高通量又得到更高的分析靈敏度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100高效液相色譜儀-UV檢測器，Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm);Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀-UV檢測器，Waters Acquity UPLC BEH RP18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)。XS-205 電子天平(Mettler公司);SL502 N電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司);KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);3k30型冷凍離心機(Sigma公司);N-EVAPTM112型氮吹儀(美國Organomation公司);20通道固相萃取裝置(Waters公司);MS2 minishaker渦旋混勻器(IKA公司)。色譜純乙腈，甲醇;分析純磷酸，正己烷，正丙醇，無水硫酸鈉;去離子水。磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉和磺胺甲惡唑標準品:購自SIGMA公司，含量均不少于99%。固相萃取柱:Waters Sep-Pak堿性氧化鋁柱，2 g/12 cc。

標準儲備液的配制(500 μg/mL):分別準確稱取磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉和磺胺甲惡唑50.0 mg(準確至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶，用少量甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，混勻，濃度為500 μg/mL，置于4℃冷藏避光保存。

混合標準工作液:分別精密量取1.00 mL 5種磺胺類藥物標準儲備液，用甲醇定容至100 mL，濃度為5 μg/mL的標準工作液，置于4℃冷藏避光保存。

1.2 樣品前處理

1.2.1 制樣 取適量空白豬肉樣品絞碎勻漿，作為空白試料，添加適宜濃度的標準濃液，作為空白添加試料。

1.2.2 提取與凈化 稱取組織樣品5 g(精確到0.1 g)，加入乙腈25 mL，無水硫酸鈉少許，渦旋震蕩15 s后，以4000 r/min的速度離心5 min。上清液移至分液漏斗中，分離后的殘渣再用25 mL乙腈提取處理，渦旋震蕩15 s后，以4000 r/min的速度離心5 min。合并兩次的上清液，加入正己烷30 mL毫升，振搖2 min后，靜置分層，取下層液體，加入正丙醇10 mL，50℃下減壓濃縮至近干，殘留物用95%乙腈3 mL溶解，過Waters Sep-Pak堿性氧化鋁柱(預先經5 mL 95%乙腈活化)。用95%乙腈5 mL淋洗，再用70%乙腈10 mL洗脫后，洗脫液中加入5 mL正丙醇，50℃下減壓濃縮至近干，殘留物用2.0 mL流動相溶解，用0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液作為試樣溶液，供液相色譜儀進行檢測。

1.3 分析條件

1.3.1 HPLC色譜條件 色譜柱:Waters symmetry C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相:乙腈 -甲醇 -水 -乙酸(2 ∶2∶9 ∶0.2)，流速1 mL/min，檢測波長270 nm，柱溫30℃，進樣量50 μL

1.3.2 UPLC色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH RP18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)，流動相:乙腈 -甲醇 -水 -乙酸(2∶2∶10∶0.2)，流速0.4 mL/min，檢測波長270 nm，柱溫30℃，進樣量 5 μL。

1.4 測定法 取適量相應濃度的標準液和試樣溶液注入液相色譜儀，作單點或多點校準，以色譜峰面積定量。標準工作液及試樣中磺胺類藥物的響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內，試樣液測定過程中要參插注入標準工作液，以便準確定量。

2 UPLC方法學考察

2.1 線性關系考察 精密量取標準工作液適量，加甲醇稀釋制成為 0.01、0.05、0.10、0.25、0.50 μg/mL的標準溶液。按設定色譜條件進行線性分析，以溶液濃度(μg/mL)為X，以峰面積為Y，繪制標準工作曲線。結果表明，各種化合物的質量濃度在10～500 ng/mL范圍內線性良好，相關系數均大于0.9990。

2.2 儀器精密度試驗 取50 ng/mL對照品溶液，在UPLC儀器上重復進樣6次，各磺胺類藥物峰面積的RSD為0.5%。表明儀器精密度良好。

2.3 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液5 μL，分別于 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 進樣，測得各藥物峰面積的RSD為0.5%。

2.4 添加回收率的驗證 取空白樣品試料分別向其中加入 50 μg/kg、100 μg/kg 和 200 μg/kg 濃度的磺胺類藥物混合標準溶液。進行提取、凈化及色譜分析。每個添加水平作5份平行測定，結果表明:平均回收率為70.5% ～101%，相對標準偏差為4.9% ～11.0%，結果見表1。

表1 豬肉中5種磺胺類藥物的添加回收率和精密度

3 豬肉中磺胺類藥物殘留在HPLC和UPLC中的測定結果比較

取同一批號的空白豬肉樣品，加適量混合標準工作液，使磺胺類藥物的加標濃度為100 μg/kg，按1.2.2項下的方法處理后，按各自液相色譜檢測條件檢測磺胺類藥物的殘留量。每個濃度點取5份樣品，求其平均回收率。結果表明，UPLC和HPLC方法所測得的豬肉中磺胺類藥物殘留量的測定結果一致，結果見表2，色譜圖比較見圖1和圖2。

圖1 磺胺類藥物殘留測定的HPLC圖譜

圖2 磺胺類藥物殘留測定的UPLC圖譜

表2 UPLC與HPLC儀測定豬肉中磺胺類藥物殘留結果比對

4 討論

4.1 流動相的選擇 以UPLC法考察不同比例的各溶劑系統，結果發現將流動相:乙腈 -甲醇-水-乙酸(2∶2∶9∶0.2)調整為乙腈-甲醇-水-乙酸(2∶2∶10∶0.2)時，分離度及峰形更好。

4.2 小結 本試驗中以UPLC法測定豬肉中磺胺類藥物殘留的檢測按農牧發[2003]1號《獸藥殘留試驗技術規范(試行)》進行了方法學研究，符合要求。本試驗根據農牧發[2001]38號測定項下方法，比較了UPLC法與HPLC法磺胺殘留測定結果，可看出兩法測定結果誤差在規定范圍以內。UPLC法具有快速、高分離度等優勢，將HPLC定量方法轉換并優化為UPLC方法，在保證含量測定結果準確的前提下，將提高色譜峰分離度，減少溶劑損耗及廢液處置費用，減少分析時間，降低分析成本，提高了分析通量。

[1]Wirth M J.Mass transport in sub-2- μm high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2007，1148(1):128.

[2]段振娟，張鴻雁，王 碩.動物性食品中磺胺類藥物殘留分析研究進展[J].食品研究與開發，2007，28(6):149-152.

[3]萬春花，龍洲雄.磺胺類藥物殘留的色譜分析進展[J].現代科學儀器，2008，18(2):99-104.

[4]農業部動物性食品中獸藥殘留檢測方法標準匯編[S].北京:中國農業科學技術出版社，2009:179-183.

[5]農業部.農業部文件農牧發[2003]1號.關于發布《獸藥殘留試驗技術規范(試行)》的通知[S].