LC－MS／MS測定豬尿中的黃曲霉毒素M1

呂 飛，鐘偉龍，朱事康，吳云普，周 宇，曹維強(qiáng)，余優(yōu)軍

（惠州出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)中心，廣東 惠州516006）

黃曲霉毒素 M1（AFTM1）是黃曲霉毒素B1的4－羥基衍生物，是AFTB1在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物［1－2］，一部分從尿和乳汁排出，另一部分存在于動物的可食部分中。主要存在于土壤、動植物、霉變谷物、各種堅果、食品、調(diào)味品、食用油、牛奶和奶制品等霉變制品中［3］，直接或間接進(jìn)入人類食物鏈，是致癌致畸致突變的毒物，嚴(yán)重威脅人類健康和生命安全。目前，測定的方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、質(zhì)譜法和放射免疫測定法。常見的檢測基質(zhì)有糧油、奶制品、動物性食品、飼料、真菌和花生制品。但對豬尿的直接檢測還未見有相關(guān)的檢測方法。本文選擇尿液作為檢測基質(zhì)主要是考慮取樣簡便和成本低廉。

目前世界各國對黃曲霉毒素M1的限量標(biāo)準(zhǔn)意見不統(tǒng)一。歐盟提出乳中黃曲霉毒素M1的限量為0.05μg／kg；美國、日本等國提出的限量為 0.5 μg／kg［4］。我國也只是在相關(guān)嬰幼兒的產(chǎn)品中做了一些限量標(biāo)準(zhǔn)（見表1），對包括豬尿樣在內(nèi)的其他樣品均未涉及限量標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 豬尿（實驗室檢測樣品）；黃曲霉毒素 M1標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞95.0%，CNS：6795－23－9）；甲醇、乙腈、甲酸（均為色譜純）德國Meker公司；水為GB／T 6682規(guī)定的一級水。

1.2 儀器與設(shè)備 AB 3200QTRap液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，配Agilent1200型液相色譜儀 恒信業(yè)（香港）有限公司；MS2振蕩器、Waters固相萃取裝置廣州市華粵行儀器有限公司；免疫親和層析柱Agela Technologies；0.22μm有機(jī)相濾膜 廣州振祥有限公司。

表1 我國規(guī)定食品中黃曲霉毒素M1最大限量值 （μg／kg）

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇稀釋并定容至10mL棕色容量瓶中，搖勻，制備成質(zhì)量濃度為10.0mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于－20℃冰箱保存。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇制備成質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.08、0.10、0.50μg／L的標(biāo)準(zhǔn)使用液，標(biāo)準(zhǔn)使用液使用前配制。以組分的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。外標(biāo)法定量。

1.3.2 分離條件［5］（1）液相色譜分離條件：色譜柱為 Aglient XDB－C18（50mm×4.6mm，1.8 μm）；流速為0.3mL／min；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為35℃。流動相為A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈＋甲醇（1＋1）；梯度洗脫（見表2）。（2）質(zhì)譜參考條件及檢測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM），詳見表3中母離子、子離子和碰撞能量。

表2 液相色譜梯度洗脫條件

表3 離子選擇參數(shù)表

1.3.3 樣品處理 （1）提取：準(zhǔn)確量取5.0mL（精確到0.01mL）豬尿樣置于50mL離心管中，用超純水定容到50mL，旋渦混合1min，待凈化。（2）凈化：將一次性的50mL注射器筒與親和柱串聯(lián)，再將親和柱與固相萃取裝置連接起來。將待凈化液倒入50mL的注射器筒內(nèi)，去掉親和柱下方堵頭，調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以每秒1滴的速度流出，待液體排干后，更換新的50mL的注射器筒，用10mL水溶液洗滌1次，流速為每秒2滴，待液體排干后，更換新的注射器筒，用1mL甲醇洗脫，流速為每秒1滴，洗脫液過0.22μm 濾膜后上LC－MS／MS檢測。（3）樣品測定：取供上機(jī)檢測的樣品溶液10μL注入儀器中。根據(jù)樣液中黃曲霉毒素M1含量的情況，選取相應(yīng)值相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和待測樣液中黃曲霉毒素M1含量的相應(yīng)值均應(yīng)在儀器的線性范圍內(nèi)，對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測定。與標(biāo)準(zhǔn)的保留時間比較定性，外標(biāo)法定量。在1.3.2節(jié)分離條件下，黃曲霉毒素 M1的參考保留時間為2.32min左右。

2 結(jié)果與分析［6－11］

2.1 樣品的預(yù)處理

2.1.1 提取溶劑的選擇 因為奶粉中黃曲霉毒素M1用超純水溶解進(jìn)行檢測，也考慮用水對豬尿進(jìn)行稀釋過免疫親和柱，進(jìn)行添加回收率的試驗結(jié)果較好，所以采用水作為提取溶劑。

2.1.2 洗脫液的選擇 因為黃曲霉毒素M1易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑中，而且標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制選用了甲醇，所以用甲醇作為洗脫液，試驗結(jié)果也同時表明可以用甲醇做洗脫液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)色譜圖和樣品加標(biāo)色譜圖 按照以上的測定方法得到黃曲霉毒素M1的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，樣品空白色譜圖和樣品加標(biāo)（0.10μg／L）色譜圖（圖1～3）。

2.3 方法的線性關(guān)系 黃曲霉毒素 M1在0.01 μg／L～0.50μg／L內(nèi)線性關(guān)系顯著，相關(guān)系數(shù)為0.999。

2.4 最低檢測限 黃曲霉毒素M1的最低檢測限為0.01μg／kg。

2.5 方法的加標(biāo)回收率 由表4可見，在添加濃度在0.01～0.10μg／kg范圍內(nèi)，回收率在74.5%～94.0%之間，RSD在2.32%～3.90%之間，樣品的回收效果較好。

表4 樣品加標(biāo)平均回收率 （n＝6）

3 結(jié)語

本試驗旨在建立豬尿中黃曲霉毒素M1的LC－MS／MS檢測方法。實現(xiàn)豬尿中黃曲霉毒素M1的快速檢測。此法操作簡便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，樣品處理簡便易行，適用于測定豬尿中黃曲霉毒素 M1。

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