X射線照射對體外培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細胞增殖和睪酮分泌的影響

鄭小波，何 濤，肖 榕，卿利娟，吳 群，李 婧，葛 亮，鄭之琬

（1.西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系，重慶 榮昌402460；2.西南大學動物科技學院，重慶 北碚400716）

睪丸間質(zhì)細胞（Leydig Cell，LC），分布于生精小管間的疏松結(jié)締組織中，是合成和分泌雄性激素的主要細胞［1］，大約95%的雄激素是由它合成和分泌的［2］，其分泌睪酮的能力取決于單個細胞的分泌功能和具有分泌功能細胞的數(shù)量［3］。從1895年11月8日德國物理學家威.康.倫琴發(fā)現(xiàn)X射線100多年來，X射線已用于醫(yī)療衛(wèi)生工作之中。但X射線對使用者和被使用者的危害不容忽視。國內(nèi)外許多文獻報道了X射線與生殖細胞的相關(guān)性研究。但是很少報道X射線對性激素生成的影響。豬的睪酮分泌方式與人相似，而且仔豬未成熟的間質(zhì)細胞在體外能保持較長時間的分泌功能，能更好推測X射線對人睪酮分泌的影響。因此本試驗以仔豬為材料，利用體外培養(yǎng)方法，通過不同放射劑量X射線照射睪丸間質(zhì)細胞，測定睪酮含量變化，同時利用MTT法觀察X射線照射對仔豬睪丸間質(zhì)細胞增殖的影響，從而為探討X射線對人體生殖影響及其防護提供新的試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 1640培養(yǎng)基（GIBCO），hCG、牛血清白蛋白（BSA）、I型膠原酶（Sigma公司），睪酮 ELISA 檢測試劑盒（ADL）、MTT、DMSO，X射線機（PLX100）。

1.2 試驗動物 3周齡長白仔豬，采自重慶畜牧科學研究院。

1.3 試驗方法

1.3.1 仔豬睪丸間質(zhì)細胞的分離和培養(yǎng) 無菌條件下采集3周齡的仔豬睪丸，放入盛有雙抗的冰浴PBS中，并迅速送回實驗室。進入細胞培養(yǎng)室，酒精擦拭睪丸表面，并用含雙抗的PBS清洗3次，剝離被膜，分離出睪丸間質(zhì)細胞，將睪丸組織剪碎為1 mm大的小塊。1 000r／min離心5min，棄上清，加入PBS稀釋，重復(fù)離心3次。在37℃下，不完全培養(yǎng)基中，膠原酶消化液消化90min，1 000r／min離心5min，留沉淀。將沉淀用PBS進行稀釋，1 000 r／min離心5min，留沉淀。用培養(yǎng)液溶解沉淀，移液槍輕輕吹打，使其分散成為單細胞，再用200目細胞篩過濾，濾液用苔盼藍染色，血細胞計數(shù)板計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果將間質(zhì)細胞濃度調(diào)整至1×108細胞／mL，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞進行3β－HDS酶活檢測［4］.

1.3.2 照射劑量的處理 根據(jù)計數(shù)結(jié)果將間質(zhì)細胞稀釋至1×108細胞／mL，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)的細胞分為5個試驗組和一陰性對照組，各組均加入50IU／mL的hCG［5］，再給予試驗組不同劑量的X射線照射［6］，試驗組照射劑量分別為54kvp、6.4mAs、84.86μGy，66kvp、2.5 mAs、75.83μGy，62kvp、3.2mAs、63.16μGy，73 kvp、1.6mAs、49.96μGy，84kvp、1.0mAs、43.12 μGy，陰性對照組照射劑量為零，X射線發(fā)射器與培養(yǎng)物的距離設(shè)為150cm，每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.3.3 照射時間的處理 根據(jù)1.3.2的培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)的細胞分為3個試驗組和一陰性對照組，各組均加入50IU／mL的hCG，選擇63.16μGy為試驗組照射不同時間的X射線，照射時間分別為0，5，15，30min。

1.3.4 不同時間和劑量的X射線影響仔豬睪丸間質(zhì)細胞的增殖 加入180μL細胞培養(yǎng)液于96孔板中，使待測細胞密度為10 000～100 000細胞／孔，細胞培養(yǎng)及處理方法同1.3.2和1.3.3，培養(yǎng)48h后分別予以50IU／mL的hCG及不同劑量的X射線照射如表1，每個劑量3個重復(fù)。再培養(yǎng)20h后，各組同時加入5g／L的 MTT 20μL；37℃，培養(yǎng)4h；吸去 MTT，加150μL DMSO，37℃，反應(yīng)15min，酶標儀于450nm波長檢測吸光度（A）值。抑制率（IR）%＝（A對照組－A試驗組）／A對照組×100%。以抑制率大于30%為敏感［5］。

1.3.5 不同時間和劑量的X射線影響仔豬睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌 按1.3.2和1.3.3的培養(yǎng)方法及處理方法所得的細胞在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h，1 000r／inm離心5min，收集培養(yǎng)液，待測。取出酶標板，依次加入50μL的標準品于空白微孔中；標記樣品編號，并加入50μL樣品于空白微孔中；在標準品孔和樣品孔中各加入100μL的酶標記溶液；37℃孵育反應(yīng)1h；用1∶20的濃縮洗液與醫(yī)用蒸餾水稀釋液清洗酶標板5次，每次靜置10～20s；再每孔加入底物A、B液各50μL；并在37℃下避光孵育反應(yīng)15min；每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。在波長450nm的酶標儀上測定OD值，繪制標準曲線，利用標準曲線得出各個劑量下的睪酮濃度值（相關(guān)系數(shù)0.812）。

1.4 統(tǒng)計學方法 用SSPS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，計量指標滿足條件用單因素方差分析，再進行q檢驗，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量X射線對仔豬睪丸間質(zhì)細胞增殖的影響 將仔豬睪丸間質(zhì)細胞按1.3.2培養(yǎng)及處理后，利用1.3.4的方法，觀察不同劑量X射線照射對LC增殖的影響，結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細胞對各個照射劑量均敏感，各劑量對細胞增殖抑制率無明顯差異（圖1）。

圖1 不同劑量的X射線照射對仔豬睪丸間質(zhì)細胞增殖抑制情況

2.2 不同時間X射線照射對仔豬睪丸間質(zhì)細胞增殖的影響 將仔豬睪丸間質(zhì)細胞按1.3.3培養(yǎng)及處理后，利用1.3.4的方法，觀察不同時間X射線照射對LC增殖的影響，結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細胞，在63.16μGy劑量下照射5、15、30min，各組LC增殖均受到抑制，且抑制率隨著照射時間的延長而逐漸上升（圖2）。

圖2 不同時間X射線照射對仔豬睪丸間質(zhì)細胞增殖抑制情況

2.3 不同劑量X射線對仔豬睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌量的影響 將仔豬睪丸間質(zhì)細胞按1.3.2培養(yǎng)及處理后，采用1.3.5的方法，利用睪酮ELISA檢測試劑盒，測定睪酮的分泌量。結(jié)果表明，在試驗組設(shè)定的照射劑量下的睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌量與對照組相比有一定的減少，但差異不顯著（P＞0.05）（圖3）。

圖3 不同劑量的X射線照射后仔豬睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌情況

2.4 不同劑量X射線對仔豬睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌量的影響 將仔豬睪丸間質(zhì)細胞按1.3.3培養(yǎng)及處理后，采用1.3.5的方法，利用睪酮ELISA檢測試劑盒，測定睪酮的分泌量。結(jié)果顯示，在63.16 μGy劑量下5min，體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），而照射15、30min，睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌量與對照組相比差異顯著（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

X射線是具有一定波長和頻率，光子能量較大的一種電磁波。X射線可能使物質(zhì)發(fā)生電離，其屬于不可見光，不帶電，通過三棱鏡時不會發(fā)生折射。性腺既具有生殖功能也具有內(nèi)分泌功能，其對電離輻射較為敏感。輻射對性腺的影響可引起不育、性細胞突變、子代異常等。睪丸具有生成精子、分泌睪酮的功能。有報道，男性全身或局部受一定劑量的輻射后，可能會出現(xiàn)精子數(shù)量減少及精子活力降低、畸形精子增多，無論是大劑量事故照射或小劑量職業(yè)照射都可致性腺損害，從而影響生育［7］。電磁波輻射可影響cAMP蛋白激酶的活性降低，也可能降低細胞內(nèi)多種酶的活性，當這些酶活性降低就可能會引起細胞增殖停止。據(jù)報道［8］，輻射可使中國倉鼠V79細胞克隆減少，而無法進入S期，這一現(xiàn)象與輻射的功率和暴露時間有關(guān)，電磁波輻射也可對細胞內(nèi)的DNA結(jié)構(gòu)和合成造成一定的影響，從而影響細胞增殖。而X射線本質(zhì)就是一種電磁波，所以試驗中仔豬睪丸間質(zhì)細胞增殖也有可能受到抑制。而長期低強度電磁脈沖作用，可通過積累效應(yīng)使細胞膜形成電穿孔［9］，從而影響細胞的活性，使細胞的增殖能力降低。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗的各劑量X射線對細胞增殖均有抑制作用，所以長期從事X射線操作的工作人員以及被操作人員都應(yīng)該做好防護。

圖4 不同時間X射線照射后仔豬睪丸間質(zhì)細胞睪酮分泌情況

X射線可影響睪丸間質(zhì)細胞的增殖，而睪丸間質(zhì)細胞主要功能就是分泌睪酮，人體血液循環(huán)中最重要的雄激素為睪酮［10］。據(jù)報道［11］，人體受50～100Gy照射后的睪丸仍能對垂體促性腺激素起反應(yīng)，0.75～6Gy照射人體的睪丸，血清睪酮的濃度無明顯變化。而本次試驗的X射線的照射劑量中的最大劑量為84.86μGy，各個輻射劑量下所分泌的睪酮量與對照組的分泌量差異不顯著（P＞0.05），一次試驗劑量對睪酮分泌的影響不大，所受到的輻射水平很低，因而對性及內(nèi)分泌功能不會造成較大的影響。值得注意的是長時間低劑量的電磁脈沖，具有積累效應(yīng)［9］。本試驗結(jié)果表明，隨著輻射時間延長間質(zhì)細胞增殖的抑制顯著增加，而睪酮分泌則顯著下降，這與牟翔［12］等的研究結(jié)果是一致的。故長時間使用X射線對畜體和人體還是存在安全隱患。所以在使用X射線診斷和治療疾病時，操作者和被操作者都應(yīng)注意必要的防護。

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