粘質沙雷氏菌幾丁質酶ChiA基因的表達及活性分析

張 表，田興華，羅滿林，趙曉瑜

（1.華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州510642；2.河南大學生命科學學院，河南 開封475004；3.河北大學生命科學學院，河北 保定071002）

幾丁質是由N－乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）單元通過β－1，4糖苷鍵構成的線性同型多聚體，主要分布在甲殼動物、昆蟲的外殼以及真菌的細胞壁中，年產量100～1 000億t，是自然界僅次于纖維素居第二位的可再生資源［1］。粘質沙雷氏菌具有高效分解幾丁質的性質，是外科手術中常見的革蘭陰性致病菌［2］。同時，幾丁質難溶于水，也不溶于稀酸和稀堿，而其產物幾丁寡糖和單體是重要的免疫增強劑且具有極強的抗菌和抗腫瘤活性［5］。幾丁質的難溶性以及粘質沙雷氏菌的致病性，長期制約了幾丁質的工業化利用。現代生物技術的發展，為徹底解決該瓶頸提供了可能［3］。本試驗通過粘質沙雷氏菌幾丁質酶的高效表達、純化及活性分析［4］，為酶法水解幾丁質提供了工業化應用前景。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 粘質沙雷氏菌ATCC27117、E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）均由本實驗室保存；載體pBV221質粒由中國科學院生物物理所靜國忠教授饋贈。

1.2 主要試劑ExTaqDNA聚合酶、EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA連接酶，購自TaKaRa公司。

1.3 目的基因的PCR擴增與純化 利用軟件Primer primier 5.0設計引物。根據 GenBank L01455，幾丁質酶基因chiA開放閱讀框為1 686 bp。本試驗設計的 引物如下：SN：5′GGAATTCATGCGCAAATTTAATAAACCG3′；ASN：5′CGGGATCCAACCGATTATTGAACGCCG 3′。 PCR反應條件：94℃，4min；循環參數：94℃，12s；42℃，10s，72℃，1min；循環數40；最后延伸：72℃，10min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并回收。

1.4 原核表達載體的構建與鑒定 將重組質粒pUC－chiA 和載體pBV221同時進行EcoRⅠ／BamHⅠ雙酶切，分別回收目的片段，將目的片段和載體片段在T4DNA連接酶的作用下，于12℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，轉化產物涂布于含100μg／mL氨芐青霉素的LB固體培養基中，37℃過夜培養后挑取陽性克隆。接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振搖過夜，提取重組表達質粒，經EcoRⅠ／BamHⅠ雙酶切鑒定，結果用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，并將陽性克隆測序。鑒定為陽性的重組表達質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，進行誘導表達。

1.5 目的基因的誘導表達與條件優化 將鑒定的重組菌接種于含Amp的LB液體培養基中，37℃活化過夜后1%轉接于含同樣抗生素的LB液體培養基，30℃培養至OD值為0.5左右，42℃誘導表達。分別于誘導前和誘導后3h、5h取菌液，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢查。

1.6 重組蛋白的純化 誘導表達3h的1L培養液，超聲破碎離心后取上清，超濾濃縮為1／10，80%飽和（NH4）2SO4沉淀該蛋白，沉淀溶解在0.02 mol／L磷酸鹽緩沖液中（pH值6.0）透析過夜。經幾丁質親和柱層析進一步純化該蛋白，將純化產物進行10%SDS－PAGE電泳。

1.7 DNS（3，5－二硝基水楊酸）定糖法測定幾丁質酶的活性 NAG標準溶液的配置：準確稱取100 mgNAG（預先在105℃干燥至恒重），用少量蒸餾水溶解后，定量轉移到100mL容量瓶中，定容到刻度，搖勻，濃度為1mg／mL。取9支25×250mm的試管，分別加入 NAG標準液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL，相對應分別加蒸餾水：2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4mL，另外每管加入1.5mL DNS試劑。將各管溶液混合均勻，沸水溫浴5min，立即冷卻至室溫，再向每管加21.5 mL蒸餾水，搖勻，于520nm波長下測OD值。表達產物活性測定如下：取20mL 42℃誘導表達3h的培養液，80Hz，20s／次超聲破碎20次，10 000r／min離心1min，取上清備用，2mL上清和23mL 1%幾丁質混合液，45℃溫育5h，在520nm波長下測OD值。酶活單位定義：在45℃下每毫升酶液每小時釋放出相當于1μg NAG的還原糖所需的酶。

1.8 溶圈法測定幾丁質酶的活性 在含1%幾丁質的LB固體培養基上，取經破壁處理的SM、pBV221／BL21、pBV－chiA5／BL21上清150μL于牛津杯中進行溶圈檢測。

2 結果

2.1 原核表達載體的構建與鑒定 經EcoRⅠ／BamHⅠ雙酶切的pBV221（3.7kb）插入chiA基因（1.7kb）后，其大小為5.4kb，重組子應比對照遷移率低，挑選5個菌落并提取質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳，初步表明所得5個轉化子明顯變大，遷移率變小，分別命名為pBV－chiA1－5（圖1）。初步確定為重組子的質粒pBV－chiA5，進行單酶切、雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳分析，出現了一條約3.7kb的pBV221載體線性片段和約1.7kb的目的片段（圖2）。酶切片段大小與預期完全相符，PCR產物大小與雙酶切小片段相同。測序結果表明，437位堿基由C變為T。

2.2 重組菌的誘導表達及產物純化 經42℃誘導的重組菌進行SDS－PAGE分析，結果表明，在約58 kDa處有一特異條帶，分子量與預期大小一致，不同誘導時間對表達量的影響差別不明顯，最佳誘導時間為3h。用軟件Alpha Imager2200對表達的蛋白進行薄層掃描分析，表明蛋白表達量約占菌體蛋白的16%，實現了蛋白在大腸桿菌中的高表達。誘導表達3h的1L培養液，經超聲破碎、80%飽和（NH4）2SO4沉淀、透析、幾丁質親和柱層析后10%SDS－PAGE電泳，純化蛋白（圖3）較為理想。

2.3 DNS定糖法結果 如表1。

根據表1：重組子△OD值為0.578，SM 的△OD值為0.128，根據公式Y＝0.459x＋0.040計算得相應的坐標點b（1.172，0.578）和點a（0.192，0.128），由酶活定義可知：酶活力＝NAG含量／（上清體積×時間），所以重組子的酶活為117.2μ／mL，SM的酶活為19.2μ／mL。

圖3 重組蛋白的SDS－PAGE分析

3.6 溶圈法測幾丁質酶活性 SM、pBV221／BL21、pBV－chiA5／BL21經破壁處理，取上清150 μL置于含幾丁質（1%）的LB固體培養基上的牛津杯中進行溶圈試驗，3d后溶圈現象明顯可見。重組菌pBV－chiA5／BL21的幾丁質酶活性明顯優于粘質沙雷氏菌SM，對照pBV221／BL21基本沒有幾丁質水解活性（圖5）。

3 結語與討論

3.1 測序結果表明，克隆的chiA基因序列大小為1 686bp，與GenBank中的L01455相比，437位堿基由C變為T，表明該基因在利用幾丁質作為碳源或氮源的沙雷氏菌屬中較為保守。

3.2 本試驗成功構建了原核表達重組質粒pBV－chiA5，該質粒在大腸桿菌BL－21中經42℃誘導后高效表達幾丁質酶，表達產物的分子量為58kDa，且主要以可溶性蛋白的形式存在。

表1 不同菌株水解幾丁質時吸光度的變化

3.3 本試驗采用了飽和（NH4）2SO4沉淀法，幾丁質親和柱層析法純化了目的蛋白，保證了幾丁質酶的活性，為固定化酶批量生產幾丁寡糖以及免疫佐劑的開發奠定了基礎。

3.4 本試驗成功構建了幾丁質酶工程菌，其產物活性明顯優于粘質沙雷氏菌。蛋白的分離純化及活性表達對生產蛋白結晶、解析晶體結構、進一步了解幾丁質酶作用的分子機制奠定了基礎。

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［3］Svein J H，Pawel S，Jannicke B C，etal.Costs and benefits of processivity in enzymatic degradation of recalcitrant polysaccharide［J］.PNAS，2006，103（48）：18089－18094.

［4］Takeshi W，Wataru O，Kazushi S，etal.Chitinase system of Bacillus circulans WL－12and importance of chitinase A1in chitin degradation［J］.Journal of Bacteriology，1990，172（7）：4017－4022.

［5］Riccardo A.A.Muzzarelli.Chitins and chitosans as immunoadjuvants and non－allergenic drug carriers［J］.Mar Drugs，2010，8：292－312.