小鼠硫酸黏桿菌素中毒神經電生理時效變化

代重山，李繼昌，馬 晶，高瑞霞

（1.東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱150030；2.東北農業(yè)大學醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150030；3.東北農業(yè)大學生命學院，黑龍江 哈爾濱150030）

近10年來，由于世界范圍內多重耐藥（MDR）革蘭陰性菌株的出現，特別是鮑曼不動桿菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌的MDR的蔓延，已成為臨床治療的棘手問題，甚至引起暴發(fā)性播散感染，導致較高的死亡率，以及新抗生素的短缺，使得已被棄用20余年的黏桿菌素重新得以評估和使用［1］。Lim等［2］認為，在未來5年，黏桿菌素將是臨床治療MDR革蘭陰性細菌感染的最佳選擇，也是最后的防線。

目前，黏桿菌素誘發(fā)的腎毒性與神經毒性嚴重阻礙著臨床應用，已經引起臨床學者及科學家的廣泛關注，但其神經毒性機制由中樞神經系統介導還是周圍神經系統介導目前還不清楚［3］。動物試驗及臨床研究發(fā)現，黏桿菌素可以引起動物或人四肢麻木、四肢無力、下肢疼痛、感覺異常、多發(fā)性周圍神經炎，這表明，黏桿菌素可能直接或間接的對周圍神經造成損傷［1，4－5］。因此，本文通過靜脈注射硫酸黏桿菌素，使用神經電生理手段評價其周圍神經毒性，分析黏桿菌素對小鼠坐骨神經電生理指標隨時間的動態(tài)變化，篩選敏感指標，為黏桿菌素神經毒性的機制研究及臨床神經毒性的早期診斷提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 BL－420E生物機能實驗系統，成都泰盟科技有限公司生產；硫酸黏桿菌素原粉（20195 U／mg），美國Sigma公司產品；戊巴比妥鈉，德國生產。

1.2 動物處理 健康雄性昆明系雌性小鼠50只，購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，適應性飼養(yǎng)1周，正式試驗時小鼠體重在18～22g，分為硫酸黏桿菌素處理組和對照組。試驗組小鼠尾靜脈注射黏桿菌素7.5mg／kg（10mL／kg體重），每天2次，間隔12 h，連續(xù)給藥7d，對照組注射生理鹽水。以給藥當天為0計，在硫酸黏桿菌素處理組在初次給藥后1，3，7 d，和15d，4個時間點，對其進行相關指標測定，每個時間點10只。常規(guī)顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水，溫度控制在（22℃±2℃），濕度（50±10）%。

1.3 步態(tài)評分 按照文獻［6］方法，將小鼠放在空曠的地面上，使其自主行動，觀察3min，進行步態(tài)評分。1分：正常步態(tài)；2分：輕微異常的步態(tài)（輕微的共濟失調，足張開，行動吃力）；3分：中度異常的步態(tài)（明顯的共濟失調，足張開，移動時肢外展）；4分：重度異常的步態(tài)（足張開，不能支持體重，無法站立）。

1.4 坐骨－脛神經電生理指標測定 試驗過程中，控制室溫在25℃±2℃，0.4%戊巴比妥鈉40mg／kg體重腹腔注射麻醉小鼠，使用加熱燈控制小鼠體溫。暴露小鼠左后肢坐骨神經干，覆蓋溫熱石蠟油，并連接鉤狀刺激電極，記錄針電極連接腳踝及小鼠第1趾間肌肉，接地電極連接刺激電極與記錄電極之間的皮膚上。將動物后足以自然肢體狀態(tài)與脊柱成45°夾角向斜后方拉直，沿坐骨神經經過部位和方向，在動物體表準確測定刺激電極到記錄電極之間的距離（s），潛伏期為刺激偽跡起始部至動作電位起始部之間的時間（t）根據v＝s／t，計算 NCV。剛開始出現動作電位波形時的刺激強度為閾刺激強度（TP）、動作電位波形達到最大時所對應的刺激電位為最大刺激強度（MI）、動作電位起始至結束間時間為復合動作電位時程（CAPD）、刺激偽跡起始部與動作電位起始部之間的距離為復合動作電位潛伏期（CAPL）、波峰波谷的高度差為復合動作電位波幅（CAPA）。所有指標在30min內完成。

1.5 數據統計 數據通過Mean±SD表示，對小鼠體重變化進行t檢驗；電生理參數、步態(tài)評分使用SPSS11.5One－Way ANOVA 統計分析；P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 一般毒性觀察 小鼠每次給藥后表現出興奮不安，隨后逐漸呆滯不動，此后腹式呼吸明顯，約10min后呼吸基本恢復正常。在第4天第1次給藥后，1只小鼠出現嚴重的抽搐，伏地不起，后緩慢恢復。從小鼠初次給藥后第4天起，試驗組大部分小鼠表現出精神抑郁，活動減少，后肢無力，直至初次給藥后第10天后，部分小鼠精神狀態(tài)逐漸開始恢復，至15d時仍然有少數小鼠表現為精神抑郁，后肢無力。

2.2 體重變化 結果見圖1，對照組小鼠在15d內持續(xù)穩(wěn)定的增長，硫酸黏桿菌素組小鼠增長速度小于對照組，在給藥后1d后體重出現負增長。在給藥后3、7d和15d體重較對照組下降9.28%（P＜0.05）、12.5%（P＜0.01）和11.3%（P＜0.01）。

2.3 步態(tài)評分變化 小鼠在初次給藥后1d、3d步態(tài)評分分別為1.20±0.42，1.23±0.44，較對照組（1±0）無顯著差異。至給藥7d和15d后步態(tài)評分分別為1.80±0.63（P＜0.05）和1.40±0.52（P＞0.05），較對照組差異不顯著。試驗中，所有步態(tài)異常的小鼠，1只在第7天出現明顯的共濟失調，步態(tài)評分為3分，其余均為2分。

2.4 坐骨神經－脛神經復合神經電生理指標的變化

2.4.1 TP與 MI 初次給藥1、3、7、15d后，與對照組相比，硫酸黏桿菌素處理后，小鼠TP逐漸增加趨勢，分別增加為59.8%，60.5%，192.5%（P＜0.01），70.1%。MI分 別增加 3.63%，12.7%，100%（P＜0.05），29.1%（圖2）。

2.4.2 CAPA、CAPL、CAPD及 NCV 初次給藥1、3、7、15d后，與對照組相比，硫酸黏桿菌素處理后，CAPA下降，分別為0.92%、16.2%、47.6%（P＜0.01）、38.8%（P＜0.05）（圖3）；潛伏期增加，分別為9.0%，9.0%，14.6%（P＜0.05），11.2%；CAPD增加，分別為15.1%，11.5%，52.8%（P＜0.05），20.6%；NCV減低，分別為7.6%，7.5%，12.7%（P＜0.05），9.3%（圖2）。

2.4.3 波形 對照組波形正常，給藥后第1天有2只小鼠出現重復性動作電位，第3、7天波形與對照組有所不同，出現三相動作電位，但未見重復行動作電位（圖3）。

圖3 靜脈注射硫酸黏桿菌素后小鼠坐骨－脛神經復合神經電記錄

3 討論

本試驗中，小鼠給藥量為7.5mg／kg體重·12h相當于臨床0.75mg／kg體重·12h。小鼠初次給藥后表現出一定的急性毒性癥狀［5］，腹式呼吸明顯，但10min內得以恢復，這可能與黏桿菌素影響機體的神經遞質相關［2，9］。小鼠步態(tài)評分趨勢、呼吸癥狀隨著給藥次數的增加而逐漸加重，可能與黏桿菌素在小鼠體內的劑量累積及時間依賴性相關［1］。硫酸黏桿菌素給藥3d、7d后，小鼠體重顯著下降，與黏桿菌素致使小鼠食欲下降，致使其體重下降相關［5］。或與黏桿菌素的肝毒性、腎毒性相關，致使腎臟對黏桿菌素的排除障礙導致黏桿菌素在體內累積造成［4，7］。

Bosso等［8］研究發(fā)現，臨床患者靜脈注射黏桿菌素后，29%的病人發(fā)生感覺異常、共濟失調。臨床研究表明，周圍神經系統不像中樞神經系統那樣有著血腦屏障的保護而更易產生毒性反應，神經電生理檢測對黏桿菌素神經毒性的監(jiān)控具有重要意義［10］。在本試驗中，神經電生理指標隨時間變化而發(fā)生時效性變化（圖2）。在連續(xù)靜脈注射硫酸黏桿菌素給藥7d后，CAPA、TP及MI顯著降低，可能與被觸發(fā)軸突的數量或神經纖維的密度相關［6］，NCV的顯著降低，可能與黏桿菌素抑制突觸前乙酰膽堿等神經遞質的釋放相關［9］。

黏桿菌素具脂質A基團模式結構，并攜帶游離陽離子氨基酸，可與高脂質含量神經元相互作用，產生神經毒性［1］。而神經髓鞘的膜性結構含有大量的不飽和脂肪酸，易受脂質過氧化損傷，使髓鞘不完整或缺失、軸突直徑發(fā)生變化，從而導致膜電容和阻抗改變，致使觸發(fā)軸突的數量的減少，或者通過脂質過氧化損傷而對神經軸突造成損傷，從而引起一系列的神經電指標發(fā)生變化。黏桿菌素可引起物質能量代謝障礙以及機體抗氧化能力的改變［11］，使細胞膜的特性發(fā)生改變；亦可能引起脊髓背根神經節(jié)細胞、腓神經軸突中鉀鈉鈣氯離子的濃度改變［12］，從而對電生理指標產生影響。

在第15天小鼠毒性行為癥狀有所緩和，但CAPA仍差異顯著，與 Wahby等［10］報道相似，即在病人因發(fā)生神經毒性而停止用藥的第5天后，CAPA顯著降低，說明黏桿菌素誘發(fā)的神經毒性具有一定的可恢復性［1，4，9］。此外，在小鼠給藥1d后，部分小鼠出現重復性動作電位（圖3－B），可能與臨床多發(fā)性神經炎相關，但在隨后的神經電生理未見此類現象，有待進一步的證實。

本試驗表明，硫酸黏桿菌素可誘導小鼠坐骨－脛神經電生理發(fā)生時效性變化，暗示黏桿菌素可造成周圍神經毒性的發(fā)生，但其作用機制還有待進一步的研究。此外，CAPA指標較為敏感，有助于臨床診斷。

［1］alasas M E，Kasiakou S K.Toxicity of polymyxins：a systematic review of the evidence from old and recent studies ［J］.CritCare，2006，10：R27.

［2］Lim L M，Ly N，Aaderson D，etal.Resurgence of colistin：a review of resistance，toxicity，pharmacodynamics，and dosing［J］.Pharmacotherapy，2010 30（12）：1279－1291.

［3］Jin L，Li J，Nation R L，etal.Impact of p－glycoprotein inhibition and lipopolysaccharide administration on blood－brain barrier transport of colistin in mice［J］.AntimicrobAgents Chemother，2011，55（2）：502－507.

［4］Wallace S J，Li J，Nation R L，etal.Subacute toxicity of colistin methanesulfonate in rats：comparison of various intravenous dosage regimens ［J］.AntimicrobAgentsChemother，2008，52（3）：1159－1161.

［5］Xiao X L，Lin B，Zhang C P.Studies on the injectable solution of colistin sulfate and its pharmacokinetics［J］.Agricultural sciencesinChina，2003，2（2）：214－221.

［6］Lopachin R M，Ross J F，Reid M L，etal.Neurological evaluation of toxic axonopathies in rats：acrylamide and 2，5－h(huán)exanedione［J］.Neurotoxicology，2002，23（1）：95－110.

［7］Chow K M，Szeto C C，Hui A C，etal.Mechanisms of antibiotic neurotoxicity in renal failure［J］.IntJAntimicrobA－gents，2004，23（3）：213－217.

［8］Bosso J A，Liptak C A，Seilheimer D K，etal.Toxicity of colistin in cystic fibrosis patients［J］.AnnPharmacother，1991，25（11）：1168－1170.

［9］Wabhy K，Chopra T，Chandrasekar P.Intravenous and inhalational colistin－induced respiratory failure ［J］.ClinInfect Dis，2010，50（6）：e38－40.

［10］Spapen H，Jacobs R，Van－Gorp V，etal.Renal and neurological side effects of colistin in critically ill patients［J］.Ann Intensive Care，2011，1（11）：14.

［11］張德顯.硫酸多黏菌素E致雞神經毒性及機制的研究［D］.哈爾濱：東北農業(yè)大學，2011.

［12］林巍.硫酸黏菌素致小鼠神經毒性初探及其毒代動力學研究［D］.哈爾濱：東北農業(yè)大學，2012.