未孕和3個月孕齡的小尾寒羊子宮內膜β－防御素的表達研究

錫林高娃，李詠蘭，弓 劍，呂桂芬，李傳剛

（1.內蒙古民族大學生命科學學院，內蒙古 通遼028000；2.內蒙古師范大學生命科學與技術學院，內蒙古 呼和浩特010022）

防御素（defensins）是廣泛分布于動物界和植物界的一類富含半胱氨酸的陽離子內源性抗微生物肽，是內源性抗微生物肽中的一個大家簇。在哺乳動物中表達的是α－防御素、β－防御素和θ－防御素［1］。β－防御素主要分布于哺乳動物黏膜上皮細胞內，被確認為黏膜表面抗微生物屏障的組成成分。在綿羊體內發現有兩種β－防御素存在［3］。小尾寒羊起源于古代北方蒙古羊，經過長期選擇和精心培育，小尾寒羊具有早熟、多胎、多羔、生長快、體格大、產肉多、裘皮好、遺傳性穩定和適應性強等優點，在世界羊業品種中被國家定為名畜良種。關于小尾寒羊防御素的研究尚未見報道。本文應用實時熒光定量PCR技術，采用相對定量法，分析未孕和懷孕小尾寒羊子宮內膜組織內β－防御素mRNA的表達量，這為進一步研究動物生殖過程中的免疫防御機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 未孕和3個月孕齡的小尾寒羊子宮內膜（取自于呼和浩特市回民屠宰場）。屠宰后，立即刮取適量子宮內膜放入液氮中，放入－70℃冰箱保存，備用。

1.2 RNA的提取 使用凱基Trizol法快速提取RNA。A260／A280值確定純度；1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性［4］。

1.3 反轉錄反應（reverse transcription）合成cDNA按SYBR ExScript RT－PCR Kit試劑盒說明書進行［5］。

1.4 β－防御素基因cDNA的實時熒光定量PCR根據GenBank中公布的羊的β－防御素（sBD－1、sBD－2）、（GBD－1、GBD－2）的cDNA 序列，利用計算機軟件DNAStar（Lasergene5.01）進行基因序列的同源性比較，根據其保守區和引物設計原則設計一對PCR引物。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。序列為：

β－防御素基因

肌動蛋白基因

1.5 cDNA的實時定量PCR 利用反轉錄合成的cDNA同時進行目的基因（sBD）PCR和內標基因（β－Actin）實時定量PCR。依次加入SYBRpremis EXTaqTM10μL，cDNA模板2.0μL，上下游引物各0.5μL，滅菌蒸餾水10μL。擴增條件：95℃預變性2min；95℃變性30s；55℃～60℃退火30s；72℃延伸20s；讀板，82℃溫育5s，讀板，40個循環；72℃延伸7min。70℃～95℃測定融解曲線。

以DNA Marker DL－2 000為標準，PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其分子量。PCR產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測定出sBD基因和β－Actin基因的Ct值［6］，則sBD基因的相對表達量為2－△CT。

2 結果與分析

2.1 熒光定量RT－PCR檢測小尾寒子宮內膜兒sBD－2表達的電泳結果 提取小尾寒羊（3月齡孕齡）子宮內膜總RNA，PCR產物電泳分析見圖1。片段大小與目的產物大小一致。為排除基因組污染對PCR體系造成的影響，設陰性對照（圖1中1、4），在相同條件下不加反轉錄酶AMV，結果顯示無擴增產物，說明該產物是以mRNA為模板擴增而來。

2.2 子宮內膜sBD基因PCR產物電泳檢測及基因測序結果 取未孕和孕齡3個月子宮內膜組織經總RNA提取、反轉錄后進行實時熒光定量PCR，擴增產物進行電泳檢測。結果見圖2。

圖2表明，小尾寒羊子宮內膜sBD基因擴增片段為303bp，β－Actin擴增片段為310bp，與設計擴增片段大小一致。

圖1 熒光熒光定量PCR電泳結果

其cDNA序列輸入GenBank數據庫，采用BLASTN進行同源性分析，結果顯示，小尾寒羊子宮內膜組織的sBD基因cDNA與文獻Ovis aries sBD－2基因的cDNA間有99%的同源性（299／300）。

2.3 子宮內膜mRNA相對定量測定 對20例未孕和懷孕小尾寒羊子宮內膜mRNA進行相對定量測定，用2－△Ct表示子宮內膜mRNA相對表達量值。未孕和懷孕小尾寒羊子宮內膜mRNA的表達量分別為2－8.95和2－5.58。

圖2 sBD、β－Actin基因PCR產物凝膠電泳

對上述PCR擴增產物進行測序，序列為：

GCCAGCATGAGGCTCCATCACCTGCTCCTCGTGCTTTTCTTCGTGGTCCTGTCTGCTGGG TCAGGATTTACTCATGGAGTAACAGATAGTCTAAGCTGCCGTTGGAAGAAAGGCATCTGTG TGCTGACCAGGTGCCCTGGAACCATGAGACAGATTGGCACCTGTTTCGGGCCCCCAGTAAAA TGCTGCAGACTGAAGTAACAGAAGGCGAAGACGCGGCCGGGACCGATGCGGAGTCAGAAAT GCTGCAGACTGAAGTAACAGAAGGCGAAGACGCGGCCGGGACCGATGCGGAGTCAGAA

3 討論

已有學者通過Northern blot雜交進行了不同日齡羔羊β－防御素mRNA的檢測，結果發現，從7日齡開始就有sBD－1的mRNA少量出現，在49日齡羔羊瘤胃內sBD－1的mRNA最豐富，以后又逐漸減少［7］。由此可見，β－防御素的表達不僅有組織特異性，而且與它的發育階段有關。在α－防御素中也存在組織表達特異性和發育階段表達特異性。1996年Mallow E B等研究出生前后胎兒、嬰兒及成人小腸內 HD－5、HD－6的基因時發現 HD－5在13.5～17周間的小腸結腸的都有二者的表達，但到了17周時，HD－5僅在小腸中表達。還發現人小腸α－防御素HD－5和HD－6在胎兒、嬰兒和成人腸道內的表達不同，即胎兒小腸內α－防御素的表達量比新生兒低，新生兒又比成年人低，同樣在各個階段HD－5的表達量比HD－6高［8］。由此揭示了防御素的表達與動物體接觸的環境因素密切相關。同時，原位雜交方法研究24周齡胎兒的潘氏細胞中防御素mRNA表達情況比相應地成體中及出生嬰兒中的潘氏細胞表達的要低，這正是未成熟的防御水平的特征。對蒙古綿羊發育過程中β－防御素的表達研究發現，sBD－2基因在十二指腸、肺、子宮中的表達均呈一致性增長趨勢，提示防御素的表達調控可能受到環境因素的多因子的動態影響［9］。

本試驗發現，懷孕3個月齡的小尾寒羊子宮內膜組織β－防御素mRNA的表達量明顯高于未孕子宮，表明β－防御素mRNA的表達隨機體的機能狀態會發生變化，在生殖生理的機體免疫中有著重要的作用。為進一步研究β－防御素mRNA的表達與生殖生理的機體免疫機制奠定理論基礎。

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