幾種抗菌藥物對嗜水氣單胞菌突變選擇窗（MSW）范圍的研究

俞觀泉，盧彤巖，楊雨輝

（1.海南大學農學院，海南 海口570228；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所 ，黑龍江 哈爾濱150070）

傳統藥效理論認為，當抗菌藥物濃度低于MIC時，容易被篩選出耐藥菌株，從而導致細菌耐藥。因此在以往的給藥方案設計中，給藥間隔的設計主要是根據MIC來確定［1］。但最近提出的突變選擇窗（Mutation Selection Windows，MSW）概念改變了傳統上的這一理論，突變選擇窗理論認為病原菌與藥物接觸過程中，有一個高于MIC的濃度范圍可以殺死或抑制敏感細菌，但是在感染細菌群體中少數自發突變耐藥的細菌則可能存活下來，并得以繁殖。一般將這個濃度范圍稱為 MSW［1－4］。突變選擇窗的下限是MIC和MIC99之間的范圍，突變選擇窗的上限被定義為當體內試驗細菌為1010個時，無耐藥突變株生長的藥物濃度，即防突變濃度（MPC）。當藥物濃度低于MIC時，由于藥物濃度較低而未作用于耐藥突變菌群，因此不會產生耐藥，但也不能達到預期的治療目的；當藥物濃度高于MPC時，由于病菌必須同時產生兩種或兩種以上的耐藥突變才能生長，因此也不可能產生耐藥；只有當藥物濃度高于MIC并低于MPC時，即藥物濃度處于MSW范圍之內的時候，才容易導致耐藥突變菌的選擇性擴增并產生耐藥性［2－4］。

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬的細菌（Aeromonas），是一種革蘭陰性兼性厭氧的短桿菌［5］。廣泛存在于淡水、污水、淤泥、土壤中，是自然界中的一種常見菌。大部分菌株一般無致病性，但致病菌株可引起魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類感染［6］。人也可以感染嗜水氣單胞菌而引起腹瀉，是一種典型的人－獸－魚共患病原菌。目前關于抗菌藥物對嗜水氣單胞菌MIC和 MBC的測定已有文獻報道［7］，但關于MSW的研究還未見報道，針對于此，本研究進行了幾種常用抗菌藥物對嗜水氣單胞菌MSW的研究，旨在為制定抗菌藥物的合理給藥方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 待測菌株 本研究使用的嗜水氣單胞菌均分離自東北三省患病的水生動物。

1.2 抗菌藥物 鹽酸恩諾沙星由浙江國邦藥業有限公司生產；氟苯尼考由湖北中牧安達藥業有限公司生產；卡那霉素（Biosharp／Amresco 0408）。

1.3 培養基 營養肉湯培養基和營養瓊脂培養基，均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.4 方法［8－10］

1.4.1 細菌數量的測定 挑取單個菌落接種于6 mL肉湯中30℃恒溫預培養12h，取0.1mL菌液接種于100mL的肉湯中30℃、100r／min震蕩培養12 h，平板計數法測細菌數量，30℃培養12h后計數。

1.4.2 MIC和MIC99的測定 試管雙倍稀釋法測MIC，把濃度為1.28mg／mL的藥液以1∶9的比例加入到肉湯中，用雙倍稀釋法稀釋至13個濃度梯度。最終不同含藥肉湯的體積均為0.5mL。把稀釋后的菌液加入到含藥肉湯中，使每個濃度的肉湯中含菌量為3×105CFU。30℃培養16～18h后觀察結果。以最低不長菌的濃度為MIC。相同過程重復5次。

在MIC的基礎上線性遞減20%抗菌藥濃度制成平板，把不同稀釋度的菌液接種于平板上，使每個藥物的濃度藥物平板上的含菌量為3×102、3×103、3×104、3×105CFU。30℃培養24h后，選合適的平板計數。限制99%的細菌生長的平板藥物濃度為MIC99。

1.4.3 MPC的測定 分別以2MIC、4MIC、8MIC、16MIC濃度的抗菌藥物制作藥物平板，濃縮菌液并調整濃度。每個藥物平板接種0.1mL菌液，每個藥物濃度4個平板，使每個濃度最終接種菌的量達到1.2×1010CFU。30℃下培養72h，觀察結果，最低不長菌的濃度為MPCpr。在MPCpr的基礎上線性遞減20%制作藥物平板，以相同的方法接種細菌。最低不長菌的濃度就是MPC。

2 結果

3種抗菌藥對5株臨床分離的嗜水氣單胞菌的MIC99和MPC結果見表1。

表1 3種抗菌藥對5個嗜水氣單胞菌的MIC99和MPC

由結果可見，卡那霉素和鹽酸恩諾沙星對5株嗜水氣單胞菌的MIC99相差不大，但MPC之間有較大的差異：卡那霉素對4號菌株的MPC明顯大于其他幾個菌株，恩諾沙星對2號菌株的MPC明顯小于其他菌株；氟苯尼考對2號菌株MIC99明顯大于其他4株嗜水氣單胞菌，而MPC值均大于128μg／mL。

3 討論

由結果可見，恩諾沙星對5株嗜水氣單胞菌MIC99相差不大，恩諾沙星對2號菌株的MPC明顯小于其他菌株，故恩諾沙星對2號菌株的MSW也明顯小于其他菌株。卡那霉素對5株嗜水氣單胞菌MIC值變化不明顯，但各菌株之間MPC有明顯差異。其中2號菌株的MPC最低，4號菌株的MPC最高。5株嗜水氣單胞菌中除2號菌株外，氟苯尼考對其他菌株的MIC相差不明顯，而2號菌株的MIC明顯高于其他菌株。由于氟苯尼考對5株嗜水氣單胞菌的MPC均高于128μg／mL而未測出，故表中標記菌株對氟苯尼考的MPC為未知。這種MIC相差不明顯，而MPC相差較大的原因，目前還不得而知，可能與菌株產生耐藥突變的基因不同有關，具體原因還需要進一步研究。

根據以前一些關于氟喹諾酮類藥物對病原菌MIC和MPC的測定結果來看，MPC／MIC的范圍在4～12之間［11－12］，在本研究中，測定的恩諾沙星對嗜水氣單胞菌的MPC／MIC在5～18之間，以前文獻報道的MPC／MIC的范圍更寬，這可能說明臨床分離的病原菌對藥物的敏感性差異非常大，同時說明了相同的給藥方案對不同病例的治療結果可能會有很大的差異。

傳統抗菌藥物的藥效學理論認為［1－2］，給藥方案的制定應該以MIC為依據，藥物濃度高于MIC是保證治療效果的最基本的要求。但MSW理論認為藥物濃度達到MIC值有一定的治療效果，但易產生耐藥菌。因而治療量應該用高于MPC的濃度。MSW理論的出現對抗菌藥物的使用和研究提出了更高的要求，該理論不僅關注治療效果，更將耐藥性的產生因素考慮在內，因此在該理論指導下制定的給藥方案更能合理應用抗菌藥物，防止耐藥性的產生和擴散。由本研究的結果與恩諾沙星和氟苯尼考現有的在水生動物體內的藥動學數據［13－15］共同分析認為，恩諾沙星在鯉魚體內藥物濃度達到峰濃度后20h以上高于MIC，但是恩諾沙星在鯉魚體內達到峰濃度后只13h和15h內分別高于4號和2號菌株的MPC，對于其他菌株維持在MPC之上的時間則較短。氟苯尼考在羅非魚體內的藥物濃度在達到峰濃度后15h時仍高于MIC，但是其峰濃度卻遠低于MPC。因此認為，目前恩諾沙星和氟苯尼考的給藥方案雖可發揮一定的治療效果，但容易導致細菌耐藥性的產生。卡那霉素由于缺乏相關的藥動數據，因此未對卡那霉素的藥效及耐藥進行分析。

［1］Drlica K.The mutant selection window and antimicrobial resistance［J］.The Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2003，52：11－17.

［2］Drlica K，Zhao X.Mutant selection window hypothesis updated［J］.Clinical Infectious Diseases，2007，44：681－688.

［3］李燕玉，裴斐，趙西林，等.耐藥突變選擇窗與抗感染藥物防突變濃度［J］.中國臨床藥理學與治療學，2004，9（1）：1－7.

［4］崔俊昌，劉又寧.抗菌藥物防突變濃度及其臨床意義［J］.國外醫學：呼吸系統分冊，2003，23（6）：312－316.

［5］布坎南R E，吉本斯 N E.伯杰細菌鑒定手冊［M］.8版.北京：科學出版社，1984：482.

［6］于學輝，王遠微，湯承，等.嗜水氣單胞菌的研究進展［J］.西南民族大學學報：自然科學版，2007，33：507－511.

［7］陳昌福，王敏.嗜水氣單胞菌對各類抗生素的敏感性測定［J］.淡水漁業，1996，26（6）：3－6.

［8］Zhao X，Eisner W，Perl－Rosenthal N，etal.Mutant Prevention Concentration of Garenoxacin（BMS－284756）for Ciprofloxacin－Susceptible of －Resistant Staplococcus aureus ［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2003，47（3）：1023－1024.

［9］翟晶，姜中其，陳儉.三種抗菌藥物對仔豬黃白痢大腸桿菌的MPC測定［J］.中國獸藥雜志，2008，42（5）：30.

［10］楊大偉，陳杖榴，丁煥中，等.頭孢喹肟對大腸桿菌防突變濃度的測定［J］.中國獸醫科學，2008，38（2）：166.

［11］梁倍倍.氟喹諾酮類藥物對大腸埃希菌防耐藥突變體選擇濃度的研究［D］.北京：中國人民解放軍軍醫進修學院，2005：45－46.

［12］茆海豐，張鵬飛.陰溝腸桿菌對氟喹諾酮類藥物防耐藥變異濃度的測定［J］.現代檢驗醫學雜志，2008，23（6）：57－59.

［13］馮敬賓，賈曉平.2種水溫條件下羅非魚體內氟苯尼考的藥物動力學比較［J］.南方水產，2008，4（4）：49－54.

［14］馮敬賓，李劉冬，賈曉平.氟苯尼考在羅非魚體內的藥物動力學［J］.南方水產，2006，2（5）：25－29.

［15］張雅斌，劉艷輝，張祚新，等.恩諾沙星在鯉體內的藥效學及藥動力學研究［J］.大連水產學院學報，2004（4）.