錦鯉皰疹病毒CJ株ORF25基因的克隆及生物信息學分析

周井祥，李新偉，朱 霞，王 好，呂文亮

(吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春 130118)

錦鯉皰疹病毒病(Kio herpesvirus disease，KHVD)是由錦鯉皰疹病毒(Kio herpesvirus，KHV)引起錦鯉、鯉魚及其普通變種如框鏡鯉等發病的一種具有高度傳染性和致死性的疾病。

該病于1998年首次在以色列的Magan Michael地區和美國爆發[1]，其后迅速傳播至英國、德國、比利時和印度尼西亞等國，2002年中國廣東省錦鯉疑似發生本病[2]，其后該病在我國頻繁爆發，給鯉魚養殖業帶來了幾乎毀滅性的打擊。

KHV是線形雙股DNA病毒，是魚類皰疹病毒屬中基因組最大的病毒[3]。它有156個開放性閱讀框(ORF)，其中只有少數已經確定其功能。ORF25和ORF99編碼膜糖蛋白，主要在細胞質中表達[4]。

目前國內還沒有有效的控制KHV的方法，本研究以吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室在國內首次分離到的錦鯉皰疹病毒吉林株(KHV-CJ)基因組為模板，成功克隆到KHV糖蛋白-ORF25基因，并分析其生物學信息，旨在為進一步研究錦鯉皰疹病毒的基因背景信息及基因工程疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)由吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室分離保存[5];框鏡鯉尾鰭原代細胞由吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室繁殖保存。

密斯·凡德羅（Ludwig Mies·Van der Rohe,1886～1969）提出了“少則多”（Lessis more）的設計原則，所謂“少”是針對當時建筑界流行的古典裝飾手法提出的，而“多”則指的是大工業條件下形式簡潔而功能豐富的建筑。該設計觀念最初是為了追求所謂的單純建筑，引起了極大的爭議，但深遠地影響了 20 世紀以來從事各個領域的設計師、設計教育，他可以說是 20 世紀對于世界設計影響最大的一個人物。

1.2 菌株與載體 pMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司，E．coli DH5α購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 主要試劑 新生牛血清、M199培養基為Invitrogen公司產品;Ex Taq DNA聚合酶、限制性內切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ、DNA Marker等購自大連寶生物工程有限公司;凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自天根生化有限公司。

（一）認知周邊一些常見物的性質、組成、以及該物質在生活當中的實際應用；形成基礎的化學概念，能對事物的微觀構成加以認知，并了解物質用途和物質性質間的關系，能自行的設計、完成基礎性的化學實驗。

1.4 引物的設計及合成 根據GenBank上登錄的錦鯉皰疹病毒 ORF25基因序列，利用 Primer Premiers 5.0軟件設計1對引物，上游引物:P1 5'-GATATCATGACGGGTTGTGGGGTT-3'，下游引物:P2 5'-GAATTCTTAGGGCCTCCGGGA-3'，分別引入EcoRⅤ和EcoRⅠ限制性酶切位點(劃線部位)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.5 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的PCR擴增 按照Hasegawa等[6]和Neukirch等[7]的方法培養細胞。將KHV-CJ病毒液接種框鏡鯉尾鰭原代細胞(MFC)單層，收集病毒后提取病毒DNA，采用25 μL反應體系進行PCR擴增，反應條件如下:95℃預變性5 min，94℃ 40 s，59.3℃30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環。

1.6 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的克隆及鑒定 將目的片段純化回收后，與pMD18-T載體連接，轉化至DH5α感受態細胞，氨芐青霉素篩選單菌落，提取重組質粒后以EcoRⅤ和EcoRⅠ雙酶切鑒定陽性重組質粒，命名為pMD18-T-25，送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

2.3.2 疏水性分析 通過ProtScale在線分析，ORF25的最大疏水指數為3.056，最小疏水指數為-3.067，其疏水性分析結果如圖3所示。

2.1 框鏡鯉尾鰭原代細胞(MFC)接種KHV后細胞病變 MFC接種KHV后，5～6 d出現細胞體積增大及少量的細胞空泡化，10 d后病變更加明顯，且細胞開始從瓶壁脫落(圖1)。

2 結果

1.8 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的系統進化樹分析 從GenBank上分別下載錦鯉皰疹病毒日本株、美國株和以色列株的基因序列，利用DNAStar6.0(MegAligen)構建不同錦鯉皰疹病毒株的ORF25基因進化樹，分析其進化關系。

“電力系統繼電保護”是由多門學科交叉的一門專業課，具體涉及電路原理、高等數學、電力電子、電機學等知識。課程的教學目的在于使學生掌握繼電保護原理以及分析方法，能夠熟練應用多種繼電保護裝置，從而解決在實際工程中的繼電保護問題。

2.2 ORF25基因的PCR擴增和鑒定 PCR擴增出一條與目的片段大小相符的DNA片段(圖2)，pMD18-T-25用EcoRⅤ和EcoRⅠ進行雙酶切，獲得一段約1824 bp的片段(圖2)，說明ORF25基因片段已成功克隆至載體中。

2.3 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的生物信息學分析

2.3.1 基因的序列測定和編碼蛋白分子特征 測序結果表明，ORF25基因長1824 bp，為一完整的開放閱讀框，編碼608個氨基酸，預測ORF25基因的理論分子質量為66825.44 Da，等電點為7.947。

1.7 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因編碼蛋白的生物信息學分析 利用DNAStar軟件翻譯出 ORF25基因的核苷酸序列;利用ProtScale(http://www.expasy.ch/tools/protscale.html)軟件分析蛋白的疏水性;利用BepiPred1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)軟件和DNAStar6.0(Protean)對ORF25序列編碼的蛋白進行抗原表位分析;分別利用 NetNGlyc1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和YinOYang1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)在線分析軟件進行N-糖基化位點和O-糖基化位點預測，利用 NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)進行磷酸化位點預測。

圖3 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25編碼蛋白的疏水性分析

2.3.4 糖基化及磷酸化位點的預測 分別通過NetNGlyc1.0在線分析軟件和YinOYang1.2在線分析軟件對錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25進行N-糖基化位點和O-糖基化位點預測。結果表明，其氨基酸序列存在6個潛在的N-糖基化位點、25個潛在的 O-糖基化位點。用NetPhos2.0在線分析軟件對錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25進行磷酸化位點進行預測，結果顯示，當閾值取0.5時，其氨基酸存在28個潛在的磷酸化位點。

（3）砍樹。現狀部分渠段渠道開口處種植有楊樹，在工程施工時需對施工有影響的樹進行砍伐。根據現場調查，本工程共伐樹1700株，其中胸徑小于15cm的有1379株，胸徑大于15cm且小于30cm的有321株。

圖4 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的抗原表位分析

2.3.3 抗原表位分析 用http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/在線軟件及 DNAStar 6.0(Protean)對錦鯉皰疹病毒ORF25基因編碼的蛋白進行抗原表位分析，得出其抗原表位主要集中在第61～69、78 ～87、109 ～136、164 ～174、179 ～196、219～257、273 ～291、357 ～372、385 ～390、476 ～524、527～573、578～606位氨基酸(圖4)。

重要性;認真落實交接班制度,做到床旁交接,護士長不定時晨會提問在班護士高風險患者;每周進行2次安全檢查,包括門窗設施、保護性用具、患者用物等[5]。

2.4 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的系統進化樹分析 從GenBank上分別下載錦鯉皰疹病毒日本株(KHV-J)、美國株(KHV-U)和以色列株(KHV-I)的ORF25基因，和本中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因構建了分子進化樹(圖5)。結果顯示，KHV-CJ與KHV-U處于一個分支，與KHV-U進化關系稍近，與KHV-I進化關系最遠。

2011-2015年，臺灣對大陸農耕產品貿易總值中所占份額較大的產品主要有谷類及其制品、水果、堅果及其制品、砂糖及其制品、茶葉及其制品、酒類、植物油和其他農耕產品；大部分農耕產品的出口值逐年增加，尤其是谷類及其制品、水果、堅果及其制品和其他農耕產品(見圖1)。

圖5 錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因的系統進化樹

3 討論

錦鯉皰疹病毒病是由錦鯉皰疹病毒(KHV)引起錦鯉(Cyprinus carpio koi)和鯉魚(Cyprinus carpio)發病的一種高致病性疾病。該病多發生在水溫為18～28℃的春秋季節，具有高度傳染性，發病率和死亡率均可高達80% ～100%[4]。目前，錦鯉皰疹病毒病已在多國爆發，造成了巨大的經濟損失。

本實驗成功獲得了長1824 bp的ORF25基因。生物信息學分析表明其表達產物抗原性良好，其氨基酸序列存在6個潛在的N-糖基化位點、25個潛在的O-糖基化位點以及28個潛在的磷酸化位點。糖基化是真核生物蛋白質翻譯前或翻譯后的一個重要修飾過程，并可提高蛋白基因組的多樣性[8]，其中N-糖基化作用位點與抗原性和免疫原性有關[9]。蛋白磷酸化是一種蛋白翻譯后的修飾作用，由蛋白激酶執行。磷酸化在多種真核細胞的生命活動中具有重要作用，例如保證有絲分裂 /細胞周期[10]、新陳代謝[10]以及信號轉導[11]的正常運行。

系統進化樹分析表明，錦鯉皰疹病毒中國吉林株(KHV-CJ)ORF25基因與美國株的進化關系最近，同源性為99%。

城鄉規劃中的農村景觀設計應遵循相應的原則，提高城鄉規劃的整體質量。為了遵循協調的原則，城鄉規劃中的農村景觀設計具有不同的內容類型，需要根據當地地形和景觀進行規劃和設計，生態保護的要求和歷史文化的特點.結合農村景觀與園林景觀的設計規劃，提高了農村景觀要素與內容的和諧統一，促進了農村景觀的良好發展。農村景觀與園林景觀的結合，規劃中地理特征的鮮明表現，區域文化的靈活融合和規劃設計的歷史發展，對提高城鄉規劃的整體質量具有催化作用。

本研究在國內首次選用KHV的糖蛋白基因-ORF25基因作為目的基因，以在我國分離到的錦鯉皰疹病毒中國吉林株的DNA作為模板，成功將其克隆，并采用生物信息學方法對其結構和功能進行了分析，為進一步研究錦鯉皰疹病毒的基因背景信息及基因工程疫苗奠定了基礎。

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