復方煤焦油酸溶液對口蹄疫病毒殺滅效果試驗

劉 瀾，張俊儒，張 強，莫 云，杜繼紅，張 雁，文 波，5，楊秀玉

(1.北京大北農動物保健技術研究中心，北京 101407;2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，蘭州 730050;3.北京市獸藥監察所，北京 100107;4.北京市朝陽區種植業養殖業服務中心，北京 100018;5.韶山大北農動物藥業有限公司，湖南韶山 411300;6.中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

口蹄疫(Foot and Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄類動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病，也是人畜共患的傳染病。可引起幼畜死亡、產奶量下降、肉品質下降、動物的生產性能降低，造成巨大的經濟損失，全世界每年由此造成的直接經濟損失可達數百億美元[1]。國際獸醫局(OIE)將其列為A類動物疫病的第一位，我國也將其列為一類動物疫病之首。在自然狀態下FMDV可經消化道感染，經呼吸道感染是最主要的傳播途徑，動物、人員及運輸工具等均可機械性地散播病毒[2]。一旦發現疫情，徹底、科學的消毒是控制疫情傳播的最好方法。復方煤焦油酸溶液主要成分為高沸點煤焦油酸、烷基苯磺酸及醋酸等，具有高效、超強廣譜、超級穩定等優點[3]。目前已在世界范圍內廣泛用于口蹄疫、禽流感等烈性傳染病的控制。本文通過試驗考察復方煤焦油酸溶液對口蹄疫病毒的殺滅效果，為其臨床應用提供科學的指導。

1 材料與方法

1.1 材料 消毒劑:韶山大北農動物藥業有限公司生產的復方煤焦油酸溶液，批號11030701;對照藥物，國外某公司生產的復方煤焦油酸溶液，批號1011LA0043;O型口蹄疫病毒ELISA檢測試劑盒，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所國家口蹄疫參考實驗室提供;實驗動物:4日齡吮乳乳鼠(清潔級昆明小鼠)，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所實驗動物場提供。

病毒的制備和稀釋:O型口蹄疫乳鼠組織毒(LD50=1×10-8.0，由中國農業科學院蘭州獸醫研究所國家口蹄疫參考實驗室提供)，用0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋成1∶500倍病毒懸液，4℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 安全性試驗 安全性試驗由中國農業科學院蘭州獸醫研究所國家口蹄疫參考實驗室進行。將復方煤焦油酸溶液用去離子水分別做1∶100、1∶200、1 ∶300、1 ∶400、1 ∶500、1 ∶600 倍稀釋，然后分組皮下注射4日齡乳鼠，每只乳鼠注射0.2 mL復方煤焦油酸溶液稀釋液，每組注射5只，同時設陰性對照組，陰性對照組乳鼠每只注射0.2 mL去離子水。每組設置4個平行。注射后連續觀察72 h，記錄乳鼠發病死亡情況。另以對照藥物替代復方煤焦油酸溶液，按上述方法進行試驗。

1.2.2 殺滅口蹄疫病毒試驗 殺滅口蹄疫病毒試驗由中國農業科學院蘭州獸醫研究所國家口蹄疫參考實驗室進行。根據安全性試驗結果，將復方煤焦油酸溶液用去離子水分別做1∶250、1∶300、1∶350、1∶400稀釋，然后依次與1 ∶500倍稀釋的 O型口蹄疫乳鼠組織毒等量混合，室溫作用30 min后皮下注射4日齡乳鼠，每只乳鼠背部皮下注射0.2 mL消毒劑-病毒混合液，每組注射5只;同時設病毒對照組，每組4只乳鼠，每只乳鼠皮下注射0.2 mL 1∶1000倍稀釋的病毒液;設健康對照組，健康對照每組2只，每只乳鼠皮下注射0.2 mL去離子水。每組設置5個平行。注射后連續觀察7 d，記錄情況。另以對照藥物替代復方煤焦油酸溶液，按上述方法進行試驗。

1.2.3 病毒抗原檢測 將各組發病死亡乳鼠的胴體加0.04 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.6)研磨后制成1∶10(W/V)懸液，健康對照組在觀察7 d后處死，同樣將胴體研磨后制成1∶10(W/V)懸液，懸液放置4℃過夜，6000 r/min離心10 min，取上清液進行ELISA檢測。ELISA檢測方法:用包被緩沖液稀釋FMDV O型兔血清至工作濃度(1∶200)，加入包被酶標板，置于4℃過夜;用PBS洗滌后加入試劑盒陽性對照和上述樣品，置于37℃旋轉振蕩器中振蕩50 min;再用PBS洗滌后加入1∶100稀釋的FMDV O型豚鼠抗血清，封板后置于37℃旋轉振蕩器中振蕩40 min;酶標板洗滌后加1∶400稀釋的酶標抗體，37℃振蕩孵育40 min;洗滌后加入鄰苯二胺(OPD)溶液(含H2O2)，37℃避光振蕩孵育15 min，加1.25 mol/L硫酸終止液，混勻后在492 nm下讀取OD值。

1.3 評判標準 消毒劑安全性判定標準:乳鼠不死亡，判為安全，反之為不安全。消毒劑殺滅病毒效果判定標準:1)病毒對照組乳鼠在接種病毒后發病死亡，并從乳鼠體內檢測到口蹄疫病毒增殖，且健康對照組試驗期間無異常表現，全部健康活潑，視為試驗成立;2)消毒劑試驗組乳鼠在試驗期間無異常表現，全部健康活潑，判定消毒劑該濃度下產品有效;3)消毒劑試驗組有乳鼠死亡，并從乳鼠體內檢測到口蹄疫病毒增殖，判定消毒劑該濃度下產品無效。

2 結果與分析

2.1 安全性試驗結果 消毒劑對乳鼠的安全性試驗發現，復方煤焦油酸溶液和對照藥物在1∶100～1∶400倍稀釋下接種乳鼠均有死亡，在1∶500和1∶600倍稀釋下均未見接種乳鼠死亡，陰性對照未發現接種乳鼠死亡。表明1∶500倍以上稀釋濃度的復方煤焦油酸溶液和對照藥物皮下注射乳鼠不會產生致死反應，乳鼠安全。安全性試驗結果如表1、表2所示。

表1 復方煤焦油酸溶液對動物的安全性測定結果

表2 對照藥物安全性測定結果

2.2 殺滅口蹄疫病毒試驗結果 根據安全性試驗結果，對殺滅口蹄疫病毒試驗的消毒劑濃度設置為1 ∶500、1 ∶600、1 ∶700、1 ∶800 倍稀釋，同時設置陽性對照和健康對照。試驗結果發現，復方煤焦油酸溶液和對照藥物在1∶500和1∶600倍稀釋下，接種乳鼠均未死亡，全部健康活潑;而在1∶700和1∶800倍稀釋下，接種乳鼠均有死亡，且1∶800倍稀釋較1∶700倍稀釋死亡乳鼠顯著增加。表明1∶500和1∶600倍稀釋濃度的復方煤焦油酸溶液和對照藥物可能滅活了O型口蹄疫乳鼠組織毒，而1∶700和1∶800倍稀釋濃度的復方煤焦油酸溶液和對照藥物可能沒有有效滅活O型口蹄疫乳鼠組織毒，導致部分乳鼠感染FMD而死亡。復方煤焦油酸溶液和對照藥物對口蹄疫病毒的殺滅效果試驗結果如表3、表4所示。

表3 復方煤焦油酸溶液殺滅口蹄疫病毒試驗結果

表4 對照藥物殺滅口蹄疫病毒試驗結果

2.3 病毒ELISA檢測結果 在對FMD病毒ELISA檢測中，攻毒用1∶500倍稀釋的O型口蹄疫乳鼠組織毒OD值為0.306;健康對照組樣品的平均OD值為0.008，表明健康對照組乳鼠未感染FMD病毒;陽性對照組的平均OD值為1.600，表明陽性對照組乳鼠均感染FMD病毒，且病毒在乳鼠體內大量增殖。實驗各組中死亡乳鼠樣品的OD值詳見表5，經SPSS 13.0統計分析，復方煤焦油酸溶液1∶700、1 ∶800 及對照藥物 1 ∶700、1 ∶800 的OD值與1∶500倍稀釋的乳鼠組織毒OD值差異極顯著(P＜0.01)，表明實驗中各死亡乳鼠被FMD病毒感染，且病毒在乳鼠體內大量增殖。

表5 FMD病毒ELISA檢測結果

3 結論與討論

口蹄疫病毒屬小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，是一種無囊膜的病毒。國內外對其抵抗力的研究中，一般認為FMDV對環境中的不利因素有較強的抵抗力，在4℃比較穩定，低溫條件下可長期存活，對熱和干燥有一定的抵抗力，對酚類、醇類等消毒劑不敏感[4]。但FMDV對酸很敏感，通過調節pH值能達到滅活口蹄疫病毒的效果，在pH 6.5的緩沖溶液中，在4℃條件下14 h內，可滅活 90%;pH 5.5時，1 min滅活90%[5]。控制口蹄疫疫情的傳統的消毒方法有10～20 g/L的氫氧化鈉、10 mL/L的甲醛溶液、50～500 g/L的碳酸鹽等浸泡或噴灑污染物，但這些消毒劑的腐蝕性和刺激性強[6-8]。

復方煤焦油酸溶液由高沸點煤焦油酸、烷基苯磺酸及醋酸等復方配制而成，具有低pH值(pH值在2.0～2.4之間)、超強的表面粘著和滲透性及生物安全等優點，目前已被世界各地廣泛選擇用于流行病的防控。在法國、英國、美國被政府指定為口蹄疫專用消毒劑，在韓國也被用于口蹄疫的控制，在泰國被用于禽流感的控制等。我國1999年版《進口獸藥質量標準》規定復方煤焦油酸溶液用于畜禽舍及器具的消毒。由Antec International-A Dupont Company生產的復方煤焦油酸溶液(FarmFliud S)自20世紀進口到我國以來，被規模豬場推崇應用于動物欄舍及環境的消毒和口蹄疫疫情的防控。國內也出現眾多的類似產品，但因其在工藝技術等方面千差萬別，導致產品在消毒效力、安全性等方面也存在較大的差異。北京大北農動物保健技術研究中心和韶山大北農動物藥業有限公司通過對復方煤焦油酸溶液配方及工藝技術等多方面的深入研究，攻克了復方煤焦油酸消毒劑制備技術難點，極大地提高了復方煤焦油酸消毒劑在消毒效力、安全性等方面特性。

上述試驗表明，此煤焦油酸消毒劑1∶600倍稀釋液在室溫條件下與O型口蹄疫乳鼠組織毒作用30 min，能100%殺滅口蹄疫病毒，可用于口蹄疫病毒污染的動物欄舍、運載工具及環境等消毒，其消毒效力、安全性等方面與國外同類產品(對照藥物)相當。

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