HPLC法測定地昔尼爾含量及有關物質

李 進，張德臣

(山東靜遠化學有限公司，濟南 250100)

地昔尼爾最早是由瑞士Ciba-Geigy公司(現為諾華公司)在1994年第八屆國際農藥化學會議披露的新型氰基嘧啶類殺蟲劑，商品名為丙蟲啶。該產品通過干擾昆蟲表皮形成來達到殺蟲的目的。地昔尼爾的抗害蟲原理，在歐洲專利GB2449746A中有詳細闡述。地昔尼爾的起效方式主要是通過噴灑在動物的體表起作用。雖然該藥市場占有率很高，但采用HPLC法對其質量進行控制的方法尚無報道。本研究采用HPLC法對其有關物質及含量進行了測定[1]。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀，包括LC-10ATVP泵、SPD-10AVP紫外檢測器及LC-solutions色譜工作站;FA2204B電子天平(萬分之一);地昔尼爾原料(山東靜遠化學有限公司，批號:091001、091002、091003);地昔尼爾對照品(百靈威科技有限公司);色譜甲醇(山東禹王實業有限公司化工分公司);雙蒸過濾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 phenomenex luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇 -水(30 ∶70)，流速1.0 mL/min，檢測波長269 nm;進樣量20 μL，柱溫25 ℃。

2.2 檢測限及定量限試驗 取地昔尼爾對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL約含0.05 mg的溶液，取上述溶液，用流動相作為溶劑，并采用逐級稀釋的方法，連續進樣，最終信噪比(S/N)約為3的濃度為0.1 μg/mL，信噪比(S/N)約為10的濃度為0.3 μg/mL。因此，本品的檢測限約為2 ng，定量限約為6 ng。

2.3 專屬性試驗 取地昔尼爾原料適量，分別進行酸、堿、氧化、高溫、光照破壞試驗。試驗結果表明:本品在酸性及堿性條件下穩定性較差，高溫、光照及氧化條件下穩定性較好，各降解的雜質均能與主峰很好的分離;取流動相進樣分析，色譜圖如圖1所示，由圖1可知溶劑不干擾本品有關物質測定，該方法專屬性良好。

圖1 空白溶劑HPLC圖譜

2.4 系統適用性試驗 取地昔尼爾原料適量加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL約含0.1 mg的溶液，作為供試液。取該供試液20 μL進樣分析，色譜圖如圖2所示，由圖2可知，本品的理論塔板數為7534，主峰與最鄰近雜質峰的分離度為8.838，因此，該方法系統適用性良好。

圖2 系統適用性HPLC圖譜

2.5 線性試驗與范圍 取地昔尼爾對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含0.05 mg的溶液，分別取該溶液 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，作為各濃度供試液。取各供試液進樣分析，試驗結果如表1所示。用峰面積對濃度進行線性回歸，線性回歸圖及線性回歸方程如圖3所示。該方法測定本品含量，濃度在1.01～20.16 μg/mL范圍內，線性關系良好。

表1 線性試驗結果

圖3 標準曲線

2.6 重復性試驗 取線性試驗項下中間濃度的供試液，進樣分析，連續進樣6次，試驗結果如表2所示。試驗結果表明，該方法測定本品含量，重復性良好。

2.7 溶液穩定性試驗 取地昔尼爾原料適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含0.1 mg的溶液，取1.0 mL加流動相稀釋至10 mL，作為供試液。將該供試液在室溫下放置8 h，分別在0、1、2、4、6、8 h 時取樣20 μL注入液相色譜儀分析，試驗結果如表3所示。試驗結果表明，本品含量測定供試液，在室溫下8 h之內，性質基本穩定。

2.8 中間精密度 取地昔尼爾原料適量，換不同的試驗人員對其進行含量測定，試驗結果如表4所示。試驗結果表明，該方法測定本品含量，中間精密度良好。

表2 重復性試驗結果

表3 穩定性試驗結果

表4 中間精密度試驗結果

2.9 回收率 精密稱取地昔尼爾原料約20、25、30 mg各三份，加甲醇溶解并稀釋至50 mL，作為供試品貯備液。取地昔尼爾對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照貯備液。精密移取各供試品貯備液1.0 mL至100 mL量瓶中，分別加入對照貯備液0.8、1.0、1.2 mL 各三份，作為80%、100%、120%組供試液;另取地昔尼爾對照品適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含0.1 mg的溶液，取1.0 mL加流動相稀釋至10 mL，作為對照品溶液。取各供試液及對照品溶液20 μL進樣分析，試驗結果如表5所示。試驗結果表明，該方法測定本品含量，回收率良好。

表5 回收率試驗結果

2.10 耐用性 分別換用不同品牌的色譜柱對本品進行測定，除保留時間略有不同外，測定結果沒有顯著差異，該方法耐用性良好。

2.11 有關物質測定 取地昔尼爾原料三批樣品，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含1.0 mg的溶液，取該溶液1.0 mL，加流動相稀釋至10 mL，作為供試液;取該供試液20 μL進樣分析，按面積歸一法計算本品的有關物質，試驗結果如表6所示。

表6 有關物質測定結果

2.12 含量測定 取地昔尼爾原料三批樣品，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL含0.1 mg的溶液，取該溶液1.0 mL，加流動相稀釋至10 mL，作為供試品溶液;取各供試品溶液20 μL注入液相色譜儀分析，記錄色譜圖如圖4所示。另取對照品同法測定，按外標法以峰面積計算本品含量，試驗結果如表7所示。

表7 含量測定結果

圖4 含量測定HPLC圖譜

3 討論與小結

3.1 波長的選擇 地昔尼爾原料在200～400 nm波長范圍內進行紫外掃描，掃描結果顯示本品的最大吸收波長為269 nm，因此選擇該波長作為本品含量測定的檢查波長。對于有關物質的測定，采用二極管陣列進行全波長測定后，最終確定選用269 nm作為有關物質的測定波長。

3.2 流動相的選擇 地昔尼爾原料的測定，通過調整甲醇與水的比例，比較利弊，選擇了甲醇 ∶水(30∶70)，在適當的范圍內調整該比例不會對測定結果產生顯著的影響[1]。不同比例的流動相測定結果如表8所示。

表8 不同比例流動相對樣品含量的測定結果

3.3 等度、梯度對分離的影響 通過采用梯度分離后，本品的雜質數量及分離度與等度洗脫比較，沒有顯著的差異，因此，選擇更為穩定的等度洗脫進行檢測。

3.4 柱溫對分離的影響 柱溫在25～30℃范圍內，測定結果不會有顯著的變化。不同溫度的測定結果如表9所示。

表9 柱溫對樣品含量測定的影響

3.5 小結 綜上所述，該方法適用于地昔尼爾的有關物質及含量測定，各方法學驗證結果均符合規定。該方法的建立，以期為地昔尼爾的質量控制及標準建立提供依據。

[1]孫毓慶，胡育筑.液相色譜溶劑系統的選擇與優化[M].北京:化學工業出版社，2007:4.