吉林白鵝α干擾素基因的原核表達及抗血清的制備

李公美，胡靜濤，李玉梅，李茂輝，閆金明，劉可越，錢愛東

(1.吉林農業大學動物科技學院，長春 130118;2.吉林大學畜牧獸醫學院，長春 130062;3.吉林正大實業有限公司，長春 130033;4.九江學院，江西九江 332000)

干擾素(interferon，IFN)是在特定的誘導劑作用下由細胞產生的一種具有高度生物學活性的糖蛋白，能使機體迅速獲得抗病毒和抗腫瘤等多方面功能[1]。IFN根據其細胞來源、生化特性及生物學活性差異，將干擾素分為兩大類:I類(IFN-α、IFN-β、IFN- ω 和 IFN- ζ)和 II類(IFN- γ)[2]，I型干擾素主要由病毒和微生物誘導產生，Ⅱ型干擾素主要由淋巴細胞受有絲分裂原或特異性抗原刺激產生。IFN-α可抑制感染細胞中病毒mRNA翻譯，并促使病毒mRNA降解，提高細胞表面MHC I類分子的表達水平，有助于向T細胞遞呈抗原，引起靶細胞的溶解，并可增強NK細胞對病毒的殺傷能力[3]。

養鵝業是我國養殖業中重要的支柱產業，許多病毒性疾病(如鵝細小病毒、鵝副粘病毒等)仍嚴重危害養鵝業。目前該類疾病的防治相對較落后，由于干擾素具有調節機體的體液免疫反應和細胞免疫反應，增強機體對細菌、寄生蟲和病毒感染的抵抗力，所以對其進行研究一直是細胞因子研究方面的重點之一。1994年，Sekellick等首次成功克隆和表達ch IFN-α基因并進行結構分析。1995年Schultz等[4]報道了鴨干擾素，并開展了鴨基因工程干擾素抗病毒的研究，Quere等[5-6]利用基因工程技術生產的重組gIFN-ɑ在禽病毒性疾病的臨床治療中得到了初步應用，而大腸桿菌作為基因工程表達系統，具有操作簡單、生產周期短、成本低、產量高等優點，因此本研究旨在利用大腸桿菌建立高效gIFN-ɑ體外表達體系，同時制備兔抗鵝IFN-ɑ多克隆抗血清，為gIFN-ɑ的臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒與毒株 鴨瘟病毒由吉林農業大學教育部動物生產及產品質量安全重點實驗室保存，含吉林白鵝IFN-α(JL-G-IFN-α)基因重組質粒pMD-T-IFN-α由本實驗室構建，E．coli BL21(DE3)、pGEX-6p-1由吉林大學獸醫研究所饋贈。

1.2 主要試劑 限制性內切酶BamH I、EcoR I、Taq DNA聚合酶及T4 DNA連接酶等均來自寶生物工程(大連)有限公司;IPTG、DNA分子質量標準、質粒DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收純化試劑盒為杭州維特潔生物技術有限公司產品;酵母浸出粉、胰蛋白胨為Oxoid公司產品;DMEM培養基、小牛血清，Invitrogen公司。GST融合蛋白純化試劑盒為Amersham Pharmacia公司產品，低分子質量蛋白質標準、預染蛋白質分子量標準為北京天根有限公司產品。

1.3 引物設計與目的基因PCR擴增 根據Gen-Bank上已發表的灰雁 IFN-ɑ序列(登錄號:HQ009755)，用Primer 5.0軟件在其完整的閱讀框架外設計上、下游引物，引物序列分別為P1:5'AT->AGGATCCAACATGCCTGGGCCATCAG 3';P2:5'TCCGAATTCTTAGCGCATGGTGCGG 3'，劃線部分分別為BamH I和EcoR I酶切位點，引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 鵝IFN-α基因的PCR擴增及擴增產物回收

以重組質粒pMD-T-IFN-ɑ為模板，PCR擴增IFN-ɑ，PCR 反應體系:ddH2O 37.5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、mix dNTPs(10 mmol/L)1 μL、IFN- ɑ P1(20 pmol/L)/IFN-ɑ P2(20 pmol/L)各1 μL、重組質粒 JL-GoIFN-α(0.5 mg/mL)1 μL、ExTaq酶(5 u/μL)0.5 μL，補超純 50 μL，混勻。PCR 反應條件為:95℃預變性8 min，94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環后，72℃延伸10 min，0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定反應產物，用凝膠回收純化試劑盒回收目的片段。

1.5 重組表達載體pMD-IFN-ɑ的構建 用BamH I和EcoR I雙酶切含鵝IFN-α基因T載體，插入到同樣經 BamH I和 EcoR I雙酶切的pGEX-6p-1表達載體的大片段中，構建重組質粒pGEX-IFN-ɑ。轉化、篩選陽性克隆，提取重組質粒進行PCR和BamH I、EcoR I酶切鑒定，對初步篩選出的陽性克隆送至寶生物工程(大連)有限公司測序。

1.6 重組質粒pGEX-IFN-ɑ的誘導表達及鑒定

將鑒定正確的重組質粒pGEX-IFN-ɑ轉化至表達宿主菌BL21中，挑單個菌落接種于5 mL含Amp的LB液體培養基中，37℃、200 r/min搖床培養。待菌液OD值為0.6～1.0時，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，30℃誘導培養6 h后收集菌體，同時設只含表達載體pGEX-6p-1的BL21和誘導后pGEX-6p-1的BL21對照。將誘導表達菌裂解產物進行SDS-PAGE和Western-blot。

1.7 重組鵝IFN-α純化 根據谷胱甘肽瓊脂糖-4B(Glutathione Sepharose-4B)操作說明書純化GST融合蛋白:(1)將谷胱甘肽瓊脂糖-4B基質轉移至一次性的小柱子;(2)輕扣小柱以除氣泡，然后讓谷胱甘肽瓊脂糖-4B基質著床;(3)移去底蓋;(4)加入10倍體積的1×PBS洗滌2次;(5)在基質中每次加入100 μL GST reduction elution buffer洗脫GST融合蛋白;(6)收集洗脫液。用SDSPAGE電泳檢查純化蛋白的純度，蛋白的濃度用BCA蛋白檢測試劑盒確定。

1.8 多克隆抗血清的制備 將1 mL純化蛋白(含目的蛋白0.25 mg/mL)加入1 mL弗氏完全佐劑中制成油乳劑，頸背部皮下多點注射免疫2月齡新西蘭白兔(由吉林大學實驗動物中心提供);首免后14 d和28 d分別用純化蛋白1 mL(含目的蛋白0.25 mg/mL)加入弗氏不完全佐劑進行第二次和第三次加強免疫，第三次免疫后10 d于心臟中采血處死兔子，按常規方法采血分離血清。將制備的血清按 1 ∶100、1 ∶200、1 ∶400、1 ∶800、1 ∶1600、1 ∶3200、1 ∶6400、1 ∶12800、1 ∶25600、1 ∶51200 稀釋，以正常兔血清為陰性對照，與1∶100稀釋的純化的鵝IFN-ɑ按常規方法進行ELISA檢測[7]。

2 結果

2.1 重組質粒pGEX-IFN-ɑ的鑒定 對重組質粒pGEX-IFN-ɑ進行PCR鑒定，結果在約570 bp處得到了1條目的條帶;用BamHⅠ和EcoRⅠ進行雙酶切鑒定，分別在約4900 bp和約570 bp處出現1條帶(圖1)，與預期結果相符。將經PCR和酶切鑒定為陽性的重組質粒測序，測序結果與鵝IFN-ɑ全基因的編碼序列完全一致。

圖1 重組質粒pGEX-IFN-α的鑒定

2.2 重組鵝IFN-ɑ基因的表達及鑒定 SDSPAGE電泳結果顯示，含有重組質粒pGEX-IFN-ɑ的重組菌液出現1條約為43.0 ku處的融合蛋白(GST-IFN-ɑ)，與預期結果相一致;而只含表達載體pGEX-6P-1的BL21，在26.0 ku處有1條明顯的蛋白帶(GST);未含重組質粒和表達載體的宿主菌BL21，沒有出現這一條帶(圖2)。表明重組質粒pGEX-IFN-ɑ在BL21中可誘導表達重組鵝ɑ干擾素融合蛋白。薄層掃描分析結果顯示，表達蛋白占菌體總蛋白的25%。SDS-PAGE電泳結束后，將凝膠上的蛋白轉印至硝酸纖維素(NC)上，用GST單抗作一抗，辣根過氧化物酶標羊抗鼠IgG作二抗進行Western blot檢測。結果(圖3)顯示，融合蛋白43.0 ku處出現一條特異條帶，同時表達空載體在26.0 ku處出現一條帶，因此根據分子質量的大小推測，這條帶的相對分子質量與目的蛋白的相對分子質量相同，表明誘導表達的目的蛋白是重組的鵝ɑ干擾素。將目的蛋白直接置于去離子水中透析復性，復性率約為62%。

2.3 重組鵝IFN-ɑ的抗血清測定 用純化的重組gIFN-ɑ作為包被抗原，對制備的兔高免血清進行ELISA檢測，結果表明，gIFN-α多克隆抗血清的抗體效價達1∶50000。

3 分析討論

干擾素具有廣譜抗病毒、抑制細胞增殖以及提高免疫功能等作用。由于病毒病一直困擾著我國的養鵝業，造成了巨大的經濟損失，因此養鵝業生產中需要干擾素類廣譜抗病毒生物制劑來治療和加強疫苗的免疫效果。干擾素存在種屬特異性，雖然克隆到的DuIFN-Ⅰ基因與雞、哺乳動物和人干擾素基因的同源性較低，但半胱氨酸殘基卻具有保守性。克隆到的DuIFN2Ⅰ基因存在著2個糖基化位點，這表明它與人和雞的Ⅰ型干擾素基因一樣，也是一種糖蛋白。夏春等[8]從鴨肝組織中提取基因組克隆到DuIFN-ɑ基因，Schultz等[4]報道了鴨干擾素，并開展了鴨基因工程干擾素抗病毒的研究，在1995年從HindⅢ消化的鴨基因組DNA中，用ChIFN-ɑ基因探針克隆了包含DuIFN-α基因的HindⅢ片段(2.7 kb)，分別在大腸埃希氏菌和COS細胞中完成了表達，并在鴨肝細胞體外培養系統中證實了其抗DHBV的能力。對人IFN的研究表明[10-11]，IFN除具有抗病毒活性外，還具免疫調節作用。Hurchen GUO 等[12]利用 pcDNA3.1/IFN-ɑ增強了FMD DNA疫苗的效果，該研究表明IFN-α作為佐劑的使用具有良好的應用前景，因此對鵝IFN-ɑ成熟片段表達產物高效純化，獲得高效價多克隆抗體，為研究機體的免疫狀態及免疫機制奠定了基礎。

本實驗選用的是pGEX-6p-1，它是一種高效誘導的原核表達載體，所表達的目的蛋白可避免宿主菌蛋白酶的水解作用，純化方便，用特異性的蛋白酶可以從所表達的融合蛋白中切下目的蛋白質或多肽;并且選用了適合于GST融合表達系統的宿主菌BL21(DE3)PlysS，該菌種缺少在細胞膜外的蛋白酶ompT的基因，還缺少多種蛋白酶，降低了重組產物表達后被細胞降解或剪切的概率。

本實驗中，經低溫誘導進行優化條件表達的蛋白始終以包涵體形式存在，盡管包涵體具有富集目標蛋白質、抗蛋白酶、對宿主菌毒性小等優點，但包涵體蛋白質的復性率一般都很低，這大大增加了基因工程產品的制造成本，本研究采用了谷胱甘肽-瓊脂糖柱進行親和層析純化，得到了較純的融合蛋白，在得到純化的目的重組蛋白后，直接在純水中透析，去除變性劑，方法簡單，且得到較高的復性率。

本實驗成功構建正確的重組質粒pGEX-6p-1/gIFN-α轉化BL21(DE3)，經IPTG誘導后，SDS-PAGE分析發現在43 ku處表達出了一條特異的融合蛋白帶，分子量與所推測的gIFN-α大小相符，蛋白產量約占菌體總蛋白的25%。在獲得復性后的gIFN-α后，對新西蘭兔進行了三次免疫，制備的多克隆抗血清抗體效價達到1∶50000。本實驗成功克隆表達、純化了gIFN-α重組蛋白，并獲得了兔抗gIFN-α多克隆抗血清，為重組鵝干擾素的臨床應用打下了基礎。

[1]Takehara K，Hyakut ake K，Imamura T，et al.Isolation，identification and plaque titration of parvovorus from Muscovy ducks in Japan[J].Avian Dis，1994，38:810-815.

[2]夏 春，吳 丹，阮小飛.禽類基因工程重組干擾素研究進展[J].動物醫學進展，2003，24(4):39-41.

[3]Aetrsson K.Molecular cloning of a gene encoding porcine interferon beta[J].J Interferon Res，1992，12(3):153-154.

[4]Schultz U，Kock J，Schlicht H J，et al.Recombinant duck interferon:a new reagent for studying the mode of interferon action against hepatitis B virus[J].Virology，1995，212:641-649.

[5]Quere P，Rivas C，Ester K，et al.Abundance of IFN-alpha and IFN-gamma mRNA in blood of resistant and susceptible chickens infected with Marek’s disease virus(MDV)or vaccinated with turkey herpesvirus and MDV inhibition of subsequent induction of IFN gene transcription[J].Arch Virol，2005，150(3):509-519.

[6]Li HT，Ma B，Mi J W，et al.Cloning，in vitro expression and bioactivity of goose interferon-alpha[J].Cytokine，2006，34(3/4):177-183.

[7]殷 震，劉景華.動物病毒學[M].第2版，北京:科學出版社，1997:422-434.

[8]夏 春，萬建青，吳志光，等.北京鴨Ⅰ型干擾素基因分子克隆與序列分析[J].畜牧獸醫學報，2000，31:567-570.

[9]Mo C W，Cao Y C，Lim B L.The in vivo and in vitro effects of chicken interferon on infectious bursal disease virus and New castle disease virus infection[J].Avian Diseases，2001，45:389-399.

[10]Hu S Y，Wu J L，Huang J H.Production of tilapia insulin like growth factor-2 in high cell density cultures of recombinant Escherichia coli[J].J Biotechnol，2004，107:161-171.

[11]趙方慶，唐志紅，林 凡，等.表達rAPC大腸桿菌的高密度發酵及純化產物的抑瘤活性[J].高技術通訊，2003，13(2):29-33.

[12]吳一凡，張雙全，高秀玉，等.乳糖誘導pET載體表達重組蛋白的研究[J].南京師大學報，2002，25(1):89-93.