高效液相色譜法同時測定魚肉中四種喹諾酮類藥物殘留

唐 巍，盧艷芬，丑亞琴，馮亞玫，徐麗君，楊 輝

(長沙市畜禽水產品質量檢測中心，長沙 410013)

恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星均屬于氟喹諾酮類藥物(quinolones，QNs)，是近20年來迅速發展起來的一類十分重要的人工合成抗菌藥物，其抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強，價格低廉，被廣泛應用于畜牧、水產等養殖業。不當使用該類藥物會造成水產品中藥物殘留，易誘發細菌耐藥性，嚴重時甚至引起食用者產生遠期毒性作用及潛在“三致(致癌、致畸、致突變)作用”[1-2]。因此，此類藥物的殘留問題越來越引起人們的關注。目前，用于QNs殘留的檢測方法有微生物法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-串聯質譜聯用法(HPLC-MS/MS)等[3-13]。本研究旨在利用高效液相色譜-熒光檢測器對魚肉中氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星殘留進行同時檢測，改進前處理方法和優化色譜條件，建立起一種簡便、快捷、準確，同時可滿足我國現行獸藥殘留檢測分析要求的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters e2695高效液相色譜儀(配有Waters2475型熒光檢測器和Empower2色譜工作站)，美國Waters公司;GM200型均質研磨儀，德國Retsch公司;MS3 basic型旋渦混合器，德國IKA公司;KQ-500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;PL602-S型電子分析天平、AG285型電子分析天平，Mettler Toledo公司;PHSJ-4A型pH計，上海雷磁公司;Heraeus Multifuge X1離心機，Thermo公司;超純水器，美國Millipore公司;Oasis HLB固相萃取柱(3cc，60mg)，美國Waters公司。標準品:氧氟沙星(99%)、諾氟沙星(99%)、恩諾沙星(99%)、環丙沙星(99%)，德國Dr.Ehrenstorfer公司;乙腈(色譜純)，德國Merck公司;四丁基溴化銨、磷酸(均為分析純);氨水(純度25%)。

1.2 標準溶液配制 分別準確稱取標準品各10.0 mg，用乙腈溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，于-20℃條件下保存。使用時取一定體積的上述標準儲備溶液混合，用流動相稀釋成質量濃度為0.002、0.005、0.025、0.05、0.5 μg/mL 的標準工作液。

1.3 色譜條件 色譜柱為Waters Atlantis T3(4.6 mm×150 mm，5μm);柱溫40℃;流動相為乙腈/7 mmol/L四丁基溴化銨溶液(磷酸調 pH 3.0)體系，體積比為6∶94;流速為1.0 mL/min;6.0 min前熒光檢測器激發波長283 nm、發射波長490 nm，6.0 min后激發波長280 nm、發射波長450 nm。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品制備 魚去鱗、去皮，沿背脊取肌肉，經組織勻漿機均質，于-20℃冰箱冷凍貯存，分析前取出置室溫解凍。

1.4.2 提取 準確稱取(5.00±0.05)g樣品，置于50 mL離心管中，加入10.0 mL四丁基溴化銨溶液(7 mmol/L，pH 2.0)，漩渦混勻 1min，再超聲 20 min，5000 r/min離心10 min，上清液全部轉移至另外一只離心管中。將殘渣重復上述步驟提取一次，合并上清液，11000 r/min離心5 min，上清液即為樣品提取液。

1.4.3 凈化 將固相萃取柱依次用3 mL甲醇和3 mL四丁基溴化銨緩沖液(7 mmol/L，pH 1.0)活化，取2.0 mL樣品提取液過柱，自然流干，再先后加入3 mL四丁基溴化銨緩沖液(7 mmol/L，pH 1.0)和2 mL 5%甲醇水淋洗。3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于玻璃試管中，45℃氮氣吹干，用1 mL流動相復溶，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，供液相色譜分析。

2 結果與討論

2.1 色譜分離 在1.3項色譜條件下，分析得到標準溶液、空白和加標魚肉樣品的色譜圖，見圖1～圖3。從圖1、圖2可知，在所采用的色譜條件下，分析物可以得到很好的分離，未發現雜質峰的干擾。

2.2 線性范圍與檢測限 配制一系列濃度的氟喹諾酮類標準混合溶液(0.002～0.5 μg/mL)，在上述色譜條件下進行測定，以各組分質量濃度與其色譜峰面積進行線性回歸，得到的線性回歸方程見表1，呈良好線性關系?？紤]到實際工作中樣品基質較為復雜，為減少雜峰的干擾，選用10倍信噪比(S/N)計算檢出限，諾氟沙星、氧氟沙星檢出限為1 μg/kg，環丙沙星、恩諾沙星檢出限1.5 μg/kg。同時，根據加標實驗情況(圖4)定量限以及四種組分同時測定的要求，確定諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星的定量限均為4 μg/kg。

表1 方法的線性范圍、線性回歸方程、相關系數和檢測限

圖4 加標魚肉樣品色譜圖(4 μg/kg)

2.3 回收率和精密度 分別對草魚、鳙魚、大黃魚加標，測定加標回收率和方法的精密度。測定結果顯示:四種氟喹諾酮在三種樣品中的平均回收率在68.5% ～106.6%之間(表2)，相對標準偏差在0.80% ～9.16%之間(表3)，說明方法的前處理提取效率和準確度滿足分析要求。

表2 方法的回收率

表3 方法的精密度

2.4 樣品提取溶劑的選擇 樣品前處理過程中提取劑的提取能力有很大差異，常用的有酸化乙腈[14]、磷酸鹽緩沖溶液[8]、二氯甲烷[15]等。本研究分別比較了四丁基溴化銨溶液、酸化乙腈、磷酸鹽緩沖溶液3種提取溶劑的提取效果，綜合比較提取效率，同時考慮有機溶劑的使用對環境造成的影響，決定采用四丁基溴化銨溶液作為提取溶劑，并進行優化。還比較了不同pH值的四丁基溴化銨溶液 (pH=1、2、3)的提取效果，結果發現，選用pH值為2的四丁基溴化銨溶液作為提取液，能夠有效提高回收率，降低雜質干擾(表4)。

表4 提取液pH值對提取效果的影響

2.5 色譜柱的選擇 對于氟喹諾酮類藥物的HPLC分析近年來一般采用C18等反相色譜柱[8-9，16]。不同型號的色譜柱因為其鍵合工藝和填料方法的不同，同樣條件下分析同樣物質會有不同的色譜行為。本研究考察了Agilent TC-C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)、Agilent XDB-C18(250 mm ×4.6 mm，5μm)和 Werters Atlantis T3(150 mm×4.6 mm，5μm)三款色譜柱。經比較，Werters Atlantis T3(150 mm ×4.6 mm，5μm)色譜柱在峰型對稱性和分離度方面都明顯優于前兩者。

2.6 檢測波長的優化 對于氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星的檢測一般都采用激發波長280 nm、發射波長 450 nm 的熒光檢測條件[8，16-17]，但氧氟沙星在激發波長280 nm、發射波長450 nm條件下，峰響應值相對較小，將影響該組分的檢測下限。因此，在檢測中考慮變換波長，在諾氟沙星出峰之前采用激發波長283 nm、發射波長490 nm的檢測波長，實驗證明氧氟沙星的峰響應值明顯提高(圖5)。

圖5 氟喹諾酮類藥物標準品檢測波長變換色譜圖對比(250 ng/mL)

3 結論

本研究采用四丁基溴化銨溶液提取、Oasis HLB固相萃取柱凈化，建立了水產品中4種喹諾酮類藥物殘留的高效液相色譜-熒光

檢測測定方法。該方法簡便、快速、精密度高，重現性好，檢出限低，能滿足我國現行獸藥殘留檢測分析的要求，可用于魚類中氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星藥物殘留的定量分析檢測。

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