高效液相色譜法測定雞鴨羊組織中環丙氨嗪殘留量

周 煒，應永飛，韋敏玨，羅成江，朱聰英

(浙江省獸藥監察所，杭州 310020)

環丙氨嗪(2-環丙氨基-4，6-二氨基-S-三嗪，cyromazine)，又名滅蠅胺、滅蛆靈、滅蠅藥或蠅得凈，是一種選擇性昆蟲生長調節劑，可誘使雙翅目幼蟲和蛹在形態上發生畸變，使成蟲羽化不全或受到抑制。2002年我國農業部批準環丙氨嗪為三類新獸藥。通過飼喂方式進入動物體內的環丙氨嗪，絕大部分以原形(約99%)及其代謝產物的形式隨糞便排出體外并沉積在糞便中，因而可用于控制動物廄舍內蠅蛆的生長發育，改善畜禽養殖場環境衛生。盡管環丙氨嗪毒性較小，但大量研究表明環丙氨嗪在動物體內的主要代謝產物是三聚氰胺。據Melnick R L等[1]的研究表明，三聚氰胺可導致動物體重下降、肝臟腫大、血液中血紅蛋白及血細胞減少、胎兒體重減輕，還可誘導小鼠膀胱腫瘤的形成，可能是一種致癌物質。

我國農業部235號公告規定了:環丙氨嗪在羊肌肉、脂肪、肝、腎中的最高殘留限量為300 μg/kg;在禽肌肉、脂肪、副產品中的最高殘留限量為50 μg/kg，但對三聚氰胺尚未制訂最高殘留限量。國內外學者對肉雞組織、雞蛋、牛奶、土壤及飼料中環丙氨嗪及其代謝物——三聚氰胺殘留量的檢測進行了大量研究，但羊組織及禽副產品中環丙氨嗪殘留量的檢測鮮有報道。已有研究表明，在大鼠、猴、羊、母雞體內，環丙氨嗪經口服后可被迅速吸收并迅速排泄，其中大于70%的環丙氨嗪以原型存在于排泄物中，三聚氰胺約為15%，氫氧化環丙氨嗪、甲基環丙氨嗪約2%[2]。亦有研究表明:三聚氰胺在動物體富集快，但代謝亦快，在低濃度飼喂豬、雞時，休藥后三聚氰胺即基本代謝完全，殘留量極少[3]。因而，結合農業部235號公告，本研究擬不考慮三聚氰胺的殘留，僅開展針對羊肌肉、脂肪、肝、腎和禽肌肉、脂肪、副產品中環丙氨嗪殘留檢測的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 環丙氨嗪標準品(97.0%)，美國Sigma公司;混合陽離子交換固相萃取柱(MCX，60mg:3mL)，美國Waters公司;Agilent 1100高效液相色譜儀(配紫外檢測器)及Agilent化學分析工作站，美國Agilent公司;Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)色譜柱、XBridgeTMHILIC(2.1 mm ×150 mm，3.0 μm)色譜柱、Atlantis HILIC(2.1 mm ×150 mm，3.0 μm)色譜柱，美國 Waters公司;XDB C18(4.6 mm ×250 mm，5.0 μm)色譜柱、RX-SIL(2.1 mm ×150 mm，5.0 μm)色譜柱，美國 Agilent公司。

1.2 標準品溶液 準確稱取環丙氨嗪標準品25 mg于25 mL容量瓶中，用甲醇配成濃度為1.0 mg/mL的標準儲備液;吸取標準儲備液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0 mg/L的標準工作液;吸取適量體積的標準工作液，用流動相稀釋含環丙氨嗪為0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0 mg/L的系列標準工作液。

1.3 色譜條件 色譜柱:XBridgeTMHILIC(2.1 mm×150 mm，3.0 μm);檢測波長214 nm;流動相為乙腈/25 mmol/L乙酸銨溶液(4∶96，V/V);柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min;進樣量20 μL。

1.4 樣品預處理

1.4.1 樣品提取 稱取(5±0.05)g試料于50 mL離心管中，加入15 mL提取液(乙腈∶1%三氯乙酸溶液，15∶85，V/V)，以 10000 r/min速度勻質1 min，再以5000 r/min離心5 min，收集上清液，然后在殘渣中再加入10 mL提取液，同樣步驟操作后合并上清液，用30 mL正己烷脫脂一次，收集乙腈相，加入5 mL異丙醇，在50℃水浴中旋轉濃縮至1 mL左右，轉移至10 mL刻度離心管中，用2 mL提取液淋洗雞心瓶，合并提取液，待凈化。

1.4.2 樣品凈化 依次用甲醇3 mL和水3 mL活化MCX固相萃取柱，將待凈化液上柱，控制過柱速度在1 mL/min以內。用甲醇3 mL、0.1 mol/L鹽酸溶液3 mL、水3 mL和甲醇3 mL淋洗固相萃取柱，抽干，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫。洗脫液在50℃下氮氣吹干，用1.0 mL流動相溶解殘渣，渦旋30 s，經0.45 μm濾膜過濾后，上機測定。

2 結果與分析

2.1 檢測條件的優化與選擇

2.1.1 檢測波長的確定 目前，國內外文獻中測定動物組織中環丙氨嗪的方法中，測定波長主要為214 nm[4-6]和 230 nm[7]，為了確定最佳檢測波長，采用紫外分光光度計對最佳檢測波長進行了考察。用甲醇稀釋環丙氨嗪標準品至5 μg/mL溶液，照分光光度法測定，所得紫外光吸收圖譜見圖1。

由圖1可知，環丙氨嗪在214 nm波長處有最大吸收，在230 nm波長處吸收值較弱，因此，確定214 nm波長為最佳檢測波長。

圖1 環丙氨嗪紫外吸收光譜圖

2.1.2 液相色譜分離條件的確定 由于環丙氨嗪的極性較強，文獻報道采用C18柱和氨基柱作為分析柱。本研究根據魏瑞成等[8]對豬肉中環丙氨嗪殘留的提取方法，制備待測組織的提取液，作為陰性基質樣本，隨后通過基質加標的方法對C18柱、氨基柱及HILIC柱的色譜分離性進行考察。

結果顯示，C18柱、氨基柱均無法實現環丙氨嗪與雜質的有效分離。而在HILIC柱條件下，當流動相中乙酸銨溶液/乙腈的比例為96∶4時，能得到較好的分離效果。羊肉樣品環丙氨嗪在HILIC色譜柱上的分離效果見圖2。

圖2 環丙氨嗪在HILIC柱上的高效液相色譜圖

2.1.3 干擾試驗 考察在HILIC色譜柱條件下其他類似藥物對環丙氨嗪分析方法的干擾。環丙氨嗪在畜禽體內主要代謝產物為三聚氰胺，本標準選用三聚氰胺進行了干擾試驗，采用環丙氨嗪的色譜條件，三聚氰胺的保留時間為8.9 min，不影響環丙氨嗪的檢測，三聚氰胺的色譜圖見圖3。

圖3 三聚氰胺標準品溶液色譜圖

2.2 樣品前處理方法的優化

2.2.1 樣品提取條件的確定 本研究比較了不同提取體積和提取次數下，乙腈/水溶液(95 ∶5、90 ∶10、85 ∶15、80 ∶20，V/V)以及1%三氯乙酸/乙腈溶液(90 ∶10、85∶15，V/V)對雞肉組織中環丙氨嗪的提取效能。具體步驟如下:取陰性樣本5.0 g，添加環丙氨嗪標準工作液適量，使之成為1.0 mg/kg陽性添加樣品，分別用10 mL或15 mL提取液進行提取，重復提取三次，提取液經旋轉蒸發濃縮至5 mL左右，經MCX混合陽離子交換柱凈化，上機測定，外標法定量。各試驗組均重復三次，結果以平均值表示，見表1所示。

表1 提取溶劑選擇及用量對環丙氨嗪提取效率的影響

從表1中可見，隨著含水量的增加，提取液的提取效率逐漸提高，但是含水量太高時，為后續的濃縮處理增加了難度。三氯乙酸具有明顯的沉淀蛋白作用，同時能改變提取環境的酸堿度為酸性，更有利于環丙氨嗪的提取，故具有更好的提取效率。綜合考慮后，選用三氯乙酸/乙腈溶液(85∶15，V/V)為提取劑。在提取體積的選擇上，發現無論是每次10 mL或15 mL提取液用量，總回收率均高于96%，且前兩次的回收率之和均高于94%。考慮到盡量減少溶劑用量和節約時間等因素，本方法采用兩次提取，第一次提取溶液用量15 mL、第二次提取溶液用量10 mL，作為樣品的提取方法。

2.2.2 濃縮凈化條件的確定 目前對于環丙氨嗪的凈化方法，主要采用液液分配和固相萃取小柱進行凈化，考慮到環丙氨嗪的極性較強，且容易得到質子形成季銨鹽的陽離子結構，故本方法采用混合陽離子交換柱進行凈化。

由于提取液提取完成后，提取液中含有大量的脂肪等干擾物質，特別是雞脂肪形成了上下兩層，需采用正己烷脫脂除去大部分的脂肪等干擾物質。本方法采用正己烷脫脂的方法，萃取體積為30 mL，脫脂后脂肪層明顯減少，而環丙氨嗪因水溶性好而沒有明顯的損失，回收率穩定。FSIS等方法采用部分提取直接進行SPE凈化，但是由于不同基質樣品中含水量不同，取固定體積上柱往往會影響到最后的體積系數，回收率不穩定。且由于取部分提取液上柱，也在很大程度上降低了方法檢測限，采用高效液相色譜法無法達到雞組織及副產物最高殘留限量中50 μg/kg的要求。故需要先對提取液進行濃縮，取濃縮液全部過柱的方法來提高方法的檢測靈敏度。由于提取液中水分比例較高，需對濃縮方法進行研究，比較氮氣吹干法和旋轉蒸發法的適用性。采用氮氣吹干法耗時費力，大大影響檢測效率，而旋轉蒸發法可通過控制系統真空度的方法，在提高前處理效率的同時保證方法的回收率，故本方法采用旋轉蒸發法將樣品提取液濃縮至1 mL左右，用2 mL左右提取液淋洗雞心瓶二次，合并提取液，充分混勻后，在10000 r/min下冷凍(-4℃)離心10 min，取上清液，備用。

本標準的固相萃取條件主要參考FSIS等方法，結合混合陽離子交換柱(MCX柱)的應用條件，建立了以下凈化步驟:取5 mL上清液樣品轉移到經3 mL甲醇、3 mL水活化的MCX固相萃取柱中，待全部溶液過柱后，再用3 mL甲醇淋洗、3 mL 0.1%鹽酸溶液淋洗、3 mL水淋洗和3 mL甲醇淋洗并抽干柱子1 min，最后用5 mL 5%氨水/甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，在50℃水浴中用氮氣吹干，加入1.0 mL流動相溶解，過濾膜后進行HPLC分析。

2.3 檢測方法的方法驗證

2.3.1 標準曲線的建立 配置標準系列工作溶液，使其濃度為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0 mg/L。在上述色譜條件下，依次注入液相色譜儀進行分析，以峰面積y對濃度x(mg/L)作標準曲線，得回歸方程:y=411．15x-8．247，R2=0．9999，結果表明:當環丙氨嗪在0.05～5.0 mg/L的濃度范圍內時，呈現良好的線性關系。

2.3.2 檢測限和定量限的確定 農業部235號公告規定，羊肌肉、脂肪、肝、腎中環丙氨嗪的最高殘留限量為300 μg/kg，而禽肌肉、脂肪、副產品中的最高殘留限量為50 μg/kg。為了滿足這個要求，采用空白樣品中添加濃度25 μg/kg環丙氨嗪的方法進行試驗，考察方法的檢測限和定量限。經回收率試驗，當動物組織中添加環丙氨嗪為25 μg/kg時，信噪比(S/N)大于10;當動物組織中添加環丙氨嗪為10 μg/kg時，信噪比(S/N)大于3。所以，本方法將動物性食品中環丙氨嗪殘留檢測的方法定量限確定為 25 μg/kg，檢測限確定為 10 μg/kg，完全能滿足實際樣品檢測的需要。

2.3.3 方法的回收率和精密度 根據我國農業部235號公告的規定:羊肌肉、脂肪、肝、腎組織中環丙氨嗪的最高殘留限量為300 μg/kg，禽肌肉、脂肪中環丙氨嗪的最高殘留限量為50 μg/kg，因而初定對25、50、100、300、600 μg/kg 五種空白添加濃度進行方法學考查，不同組織的具體添加濃度及回收率數據見表2。

表2 不同動物組織中環丙氨嗪回收率試驗 %

續表

續表

從回收率結果看出，羊肉、羊肝、羊腎和羊脂肪在25～600 μg/kg添加濃度范圍內，回收率為74.4% ～107%，批內RSD在0.9% ～11.9%之間，批間RSD在0.3% ～11.1%之間。雞肉、雞肝、雞脂肪和鴨肉在25～600 μg/kg添加濃度范圍內，回收率為74.9% ～101%，批內 RSD在1.9% ～10.7%之間，批間RSD在1.2% ～7.1%之間。由此可見回收率滿足通常70% ～120%的規定，批內RSD＜15%，批間RSD＜20%，說明本方法能滿足動物性食品中環丙氨嗪測定的需要。

2.3.4 實際樣品檢測 在本實驗設定的檢測步驟和儀器條件下，對日常監測和市場抽查的15例羊組織(肌肉、脂肪、肝臟)以及26例禽組織(雞肉、鴨肉、雞脂肪、鴨肝)進行了檢測，均未發現環丙氨嗪殘留。

3 結論

研究建立了禽、羊可食性動物組織中環丙氨嗪殘留檢測方法，采用三氯乙酸/乙腈提取，經MCX固相萃取小柱凈化后，上機檢測，外標法定量，檢測限為10 μg/kg，定量限為25 μg/kg。提取效果好，回收率在74% ～107%之間，批內RSD為0.9～11.9%，批間RSD為0.3% ～11.1%，能充分滿足動物性食品中環丙氨嗪檢測的需要，可為該藥物的監控提供技術支持和保障，對保證國際之間正常貿易往來以及保障人類健康，具有十分重要的意義和實用價值。

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