應(yīng)用固相支撐液液萃取-平行蒸發(fā)前處理技術(shù)檢測飼料中四種硝基呋喃類藥物

王彩娟，祝偉霞，楊冀州，孫轉(zhuǎn)蓮，張巨洲，張書勝

(1.河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，鄭州 450003;2.鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，鄭州 450042)

硝基呋喃是人工合成的抗菌類藥物，主要用于預(yù)防和治療沙門氏菌和大腸桿菌引起的胃腸道疾病。經(jīng)毒理學(xué)評價(jià)證明硝基呋喃類藥物具有很強(qiáng)“三致”效應(yīng)，長期使用易危害動(dòng)物及人類的身體健康，目前國內(nèi)外已全面禁止硝基呋喃類原藥作為飼料添加劑使用[1-2]。為貫徹食品安全源頭控制的監(jiān)管要求，建立一種快速、靈敏的分析方法監(jiān)督飼料中硝基呋喃類原藥的含量已勢在必行。

國內(nèi)外有關(guān)飼料中硝基呋喃原藥的檢測報(bào)道主要采用分光光度法[3]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5]、液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS)[6-8]等。飼料中硝基呋喃原藥的前處理方法主要采用有機(jī)溶劑提取和固相萃取(SPE)凈化方法，文獻(xiàn)報(bào)道了混合陰離子交換SPE柱[5]、親水 - 親脂平衡填料[6]、石墨化碳黑/氨基混合柱[7]、反相C18填料[3]等 SPE 方法凈化飼料中四種硝基呋喃原藥，農(nóng)業(yè)部1486號公告采用乙腈提取，混合型陽離子交換柱凈化[9]的前處理方法。已報(bào)道的方法需要多步溶劑轉(zhuǎn)移步驟，閆曉東等[1]測定飼料時(shí)采用乙腈提取后直接測定，但提取液中干擾物質(zhì)較多。2011年，本實(shí)驗(yàn)室采用固相支撐液液萃取-全自動(dòng)平行蒸發(fā)前處理技術(shù)建立了動(dòng)物源性食品中硝基呋喃代謝物的分析方法[10]，凈化效果理想。在此研究基礎(chǔ)上，本文采用該前處理凈化技術(shù)建立了飼料中四種硝基呋喃原藥的快速分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、藥品與試劑 Agilent 1200高效液相色譜儀(配二極管陣列檢測器，美國Agilent公司);8210超聲波提取儀(日本Yamato公司);IKA T18渦旋混勻器(德國IKA公司);CT6E離心機(jī)(日本Hitachi公司);Synore Q101平行蒸發(fā)-固相萃取儀(配真空泵、冷凝器，瑞士BüCHI公司);Chem Elut萃取柱(20 mL，美國Varian公司)。呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥97%，德國Dr.Ehrenstrofer公司)。乙酸乙酯、甲醇和乙腈(色譜純，美國Fisher公司);實(shí)驗(yàn)用水均由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備;其他試劑均為市售分析純。

1.2 分析條件 色譜柱為ZORBAX SB C 18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:A相為乙腈，B相為10 mmol/L乙酸銨溶液(pH=4)，梯度洗脫程序見表1;柱溫30℃;檢測波長365 nm;進(jìn)樣量20 μL。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟 稱取(2.00±0.02)g樣品，加入20 mL甲醇-1 mol/L(pH=7)磷酸鹽緩沖溶液(30 ∶70，V/V)，渦旋混合 3 min，超聲提取 10 min，4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于固相萃取-平行蒸發(fā)儀的Chem Elut柱，待樣液全部通過柱體后，靜置等待反應(yīng)30 min，加入20 mL乙酸乙酯以1.0 mL/min流速洗脫待測物，流出液至平行蒸發(fā)試管中，再加入20 mL乙酸乙酯重復(fù)洗脫步驟，洗脫液全部收集于平行蒸發(fā)管，以振蕩速度185 r/min、冷卻溫度-4℃，加熱溫度60℃，真空下將洗脫液濃縮至干，2 mL乙腈-10 mmol/L乙酸銨(10 ∶90，V/V)溶解殘?jiān)^0.22 μm 濾膜，待測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化 飼料中富含灰分、蛋白和碳水化合物等物質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道硝基呋喃類藥物的提取主要采用乙腈、甲醇、乙酸乙酯及其鹽溶液。本研究分別考察了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙腈-磷酸鹽、甲醇-磷酸鹽作為提取劑時(shí)的提取效率，結(jié)果表明5種提取溶劑提取四種硝基呋喃原藥回收率均≥70%，甲醇-磷酸鹽混合液提取干擾物質(zhì)少，同時(shí)該提取液與凈化方法匹配，因此實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-磷酸鹽(30∶70，V/V)作為飼料提取溶劑。

2.2 凈化方法的選擇 飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，提取液中存在的干擾物質(zhì)易影響色譜儀器分離。聚苯乙烯-二乙烯基苯柱、親水-親脂平衡填料SPE凈化方法用于硝基呋喃代謝物凈化時(shí)可獲得較高的回收率，但這些凈化方法包括多步溶劑轉(zhuǎn)移步驟，操作繁瑣耗時(shí)。本方法試驗(yàn)了固相支撐液液萃取技術(shù)用于硝基呋喃原藥分析時(shí)的效果，該方法基于樣液與硅藻土填料柱作用形成特有的“支撐骨架”萃取模式，乙酸乙酯類有機(jī)溶劑通過該柱時(shí)，目標(biāo)物被萃取至有機(jī)相，液液萃取步驟在固相萃取-平行蒸發(fā)系統(tǒng)完成，減少了有機(jī)溶劑消耗和溶劑轉(zhuǎn)移步驟，樣品的凈化和富集過程在全自動(dòng)的條件下完成，四種硝基呋喃萃取回收率≥90%，因此本實(shí)驗(yàn)選用固相支撐液液萃取作為凈化方法。

2.3 固相支撐液液萃取條件的優(yōu)化 樣液在硅藻土柱中的平衡時(shí)間是影響固相支撐液液萃取回收率的重要參數(shù)，本研究分別考察了 10、20、30、40、50、60 min平衡時(shí)間對萃取效率的影響。結(jié)果表明，溶液與硅藻土填料可在30 min時(shí)間內(nèi)形成牢固的支撐作用。同時(shí)試驗(yàn)了不同體積乙酸乙酯(5、10、15、20和25 mL)的萃取效率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5、10、15 mL的回收率約為45%，20和25 mL的回收率72%，四種硝基呋喃原藥回收率隨乙酸乙酯體積逐漸增加。試驗(yàn)選用20 mL乙酸乙酯在重力作用下分兩次萃取，四種硝基呋喃萃取回收率≥98%。

2.4 色譜條件的優(yōu)化 硝基呋喃類化合物結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)雜環(huán)共軛結(jié)構(gòu)，在紫外波長下具有特征吸收。實(shí)驗(yàn)在200～800 nm波長范圍內(nèi)對待測物進(jìn)行掃描，結(jié)果表明四種待測物在260、365 nm處均有較強(qiáng)特征吸收，其中365 nm處樣品干擾峰少，方法最終選用365 nm作為檢測波長。比較了多種商品化液相色譜柱CAPCELL PAK MGⅡC18、ZORBAX SB C18、ZORBAX Extend C18、Symmetry C18、Gemini-NX C18和YMC-ODS-AQ等的分離效果，發(fā)現(xiàn)未封端ZORBAX SB C18柱分離度好、靈敏度高。實(shí)驗(yàn)選用ZORBAX SB C18柱作為分離柱，標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1所示。

圖1 四種硝基呋喃原藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(1 μg/mL)

2.5 線性范圍和方法定量限 取一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以峰面積(Y)對相應(yīng)的濃度(X，μg/mL)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.05～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程分別為:呋喃它酮Y=109.47X-0.9327(r=0.9998)，呋喃西林Y=101．32X+0．7439(r=0．9997)， 呋 喃 妥 因Y=92．653X+0．0633(r=0．9999)，呋 喃 唑 酮Y=76．347X-0．9633(r=0．9999)。 以 信 噪 比S/N≥10為依據(jù)，四種硝基呋喃原藥的方法定量限(LOQ)為0.1 mg/kg。

2.6 方法回收率與精密度 稱取空白飼料樣品，在0.1、0.2、1.0 mg/kg三個(gè)濃度水平作加標(biāo)回收試驗(yàn)，按照本方法所述步驟每個(gè)濃度重復(fù)測定10次，空白樣品的加標(biāo)色譜圖如圖2所示，獲得方法回收率在78.4% ～105.3%，RSD為1.8% ～7.2%(表2)。

表2 方法回收率和精密度

圖2 空白飼料樣品中添加四種硝基呋喃原藥的回收色譜圖

3 結(jié)論

首次采用硅藻土固相支撐液液萃取-平行蒸發(fā)建立了濃縮飼料、預(yù)混合飼料和功能性飼料中四種硝基呋喃原藥的檢測方法，方法技術(shù)參數(shù)均滿足禁用藥物限量要求。樣品前處理集濃縮與凈化于一體，自動(dòng)化程度高，操作簡單，通過分析送檢飼料樣品，并將本方法與農(nóng)業(yè)部1486號公告中的現(xiàn)行方法進(jìn)行比較，樣品測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法的測定結(jié)果一致，相對偏差小于10%，可作為飼料中4種硝基呋喃原藥分析測定的高通量常規(guī)檢測方法。

[1]閆曉東，王克寧，張會(huì)彩，等.檢測飼料中4種硝基呋喃類藥物的簡易高效液相色譜法[J].畜牧和獸醫(yī)，2010，42(3):86-89.

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[9]農(nóng)業(yè)部1486號公告-8-2010.飼料中硝基呋喃類藥物的測定，高效液相色譜法[S].

[10]祝偉霞，袁 萍，楊冀州，等.固相支撐液液萃取-平行蒸發(fā)前處理技術(shù)測定動(dòng)物源性食品中4種硝基呋喃類代謝物[J].食品科技，2011，36(2):300-303.