馬玲薯葡萄糖培養(yǎng)基在延胡索酸泰妙菌素菌種選育中的應(yīng)用

馬繼花，張 萍，石彥鵬，張亞強(qiáng)

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所，銀川 750101)

延胡索酸泰妙菌素(Tiamulin Fumarate)是由高等真菌擔(dān)子菌側(cè)耳屬(Pleuroutus mutilus)通過(guò)發(fā)酵得到截短側(cè)耳素后，再經(jīng)過(guò)化學(xué)合成得到的氫化延胡索酸鹽，是一種雙萜烯類(lèi)獸用抗生素。本品抗菌譜與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素相似，主要抗革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)金黃色葡萄球菌、鏈球菌、支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬密螺旋體痢疾等有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)支原體的作用強(qiáng)于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi);對(duì)革蘭氏陰性菌尤其是腸道菌作用較弱。其主要用于防治雞的慢性呼吸道病、豬支原體肺炎、放線菌性胸膜肺炎和密螺旋體性痢疾等，低劑量可以促進(jìn)生長(zhǎng)，提高飼料利用率。最新研究表明，泰妙菌素與抗腫瘤藥物聯(lián)用可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性，顯示了其在腫瘤治療方面的潛在價(jià)值[1]。目前泰妙菌素菌種的生產(chǎn)能力較低，發(fā)酵產(chǎn)量低，不能滿(mǎn)足發(fā)酵行業(yè)生產(chǎn)的需要，因此，提高泰妙菌素的產(chǎn)量是生產(chǎn)企業(yè)亟待解決的問(wèn)題，而選育泰妙菌素高產(chǎn)菌株是行之有效的方法。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基是實(shí)驗(yàn)室里使用最普遍的真菌培養(yǎng)基，它也被廣泛應(yīng)用于食用菌母菌的培養(yǎng)中[2]。同樣作為真菌的擔(dān)子菌側(cè)耳屬的泰妙菌素產(chǎn)生菌，能否在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并體現(xiàn)出它獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，本文以生產(chǎn)用的麥芽浸膏培養(yǎng)基為對(duì)照，通過(guò)對(duì)菌種的分離、篩選以及采用HPLC法測(cè)定泰妙菌素的含量，最終獲得了4株高于對(duì)照的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 菌株TMⅡ10-444由寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所分離純化獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基;麥芽浸膏培養(yǎng)基:葡萄糖、麥芽浸膏、酵母膏、瓊脂粉;馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉;種瓶培養(yǎng)基:葡萄糖、硝酸鈣、消泡劑;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖、玉米漿、豆油。均參照寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.3 試劑 酵母膏和麥芽浸膏，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;瓊脂粉，青島凍粉廠;玉米漿，華北制藥康欣有限公司;硝酸鈣、硫酸鎂、葡萄糖等均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.4 儀器與設(shè)備 Waters2695/2487型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司;C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);XDW25/96 型旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)，樂(lè)山長(zhǎng)征制藥機(jī)械有限公司;凈化工作臺(tái)，無(wú)錫市榮豐凈化空調(diào)設(shè)備廠;恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 使用菌株的選擇 選擇TMⅡ10-444作為出發(fā)菌株，用麥芽浸膏培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化，搖瓶效價(jià)為14046 U/mL。

1.2.2 平板培養(yǎng)基的制備 麥芽浸膏培養(yǎng)基:用電子天平(精度0.001 g)準(zhǔn)確稱(chēng)取培養(yǎng)基所需量的葡萄糖、麥芽浸膏和酵母膏，加純化水?dāng)嚢枋蛊涑浞秩芙猓偌尤氕傊郏⒓訜崛芙庵镣噶粒瑢⑷芤旱谷肓客仓醒a(bǔ)充純化水至所需體積，攪拌均勻后分裝于750 mL三角瓶中，于120～121℃、0.10～0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，在凈化工作臺(tái)上制備成平板，待用。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:取新鮮馬鈴薯洗凈去皮，切塊后加純化水適量煮沸30 min，然后用4層紗布過(guò)濾取汁，稱(chēng)取葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、維生素B1微量，逐個(gè)用純化水溶解，再加入瓊脂粉，加熱溶解并補(bǔ)足體積至1 L，攪拌均勻后分裝于750 mL三角瓶中，于120～121℃、0.10～0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，在凈化工作臺(tái)上制備成平板，待用。

1.2.3 稀釋平板分離 鏟取斜面菌絲，置于加有生理鹽水的研磨器中，研磨至混濁、無(wú)片狀菌絲，吸取菌懸液1 mL，按照10倍稀釋法用生理鹽水稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，依次涂布于制備的兩種不同平板培養(yǎng)基上，工藝條件下置恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察平板生長(zhǎng)情況。

1.2.4 單菌落篩選

1.2.4.1 挑選單菌落 分別挑取兩種平板上生長(zhǎng)成熟的單菌落接種于麥芽浸膏斜面培養(yǎng)基上，制備成斜面，其中馬鈴薯葡萄糖平板上挑取單菌落86支，麥芽浸膏平板上挑取單菌落77支，斜面上標(biāo)注單菌落編號(hào)后置于同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日定時(shí)觀察單菌落的生長(zhǎng)情況，并記錄生長(zhǎng)過(guò)程。

1.2.4.2 初篩 以出發(fā)菌株在麥芽浸膏培養(yǎng)基上制備的斜面作為對(duì)照，將培養(yǎng)好的單菌落斜面對(duì)號(hào)接入發(fā)酵瓶，一支斜面接一個(gè)發(fā)酵瓶，同時(shí)放置同一搖瓶機(jī)上，于工藝條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后取發(fā)酵液用甲醇1∶9稀釋提取后，測(cè)定其HPLC效價(jià)。

1.2.4.3 復(fù)篩 根據(jù)初篩結(jié)果從馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中選出8支菌株進(jìn)行復(fù)篩，從麥芽浸膏培養(yǎng)基中挑選出4支菌株進(jìn)行復(fù)篩(以出發(fā)菌株在麥芽浸膏培養(yǎng)基上制備的斜面作為對(duì)照)，復(fù)篩采用二級(jí)發(fā)酵，一支斜面接一個(gè)種子瓶，培養(yǎng)成熟后接入發(fā)酵瓶培養(yǎng)基，每個(gè)種子瓶平行接三個(gè)發(fā)酵瓶，連續(xù)復(fù)篩2批，搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后取發(fā)酵液用甲醇1∶9稀釋提取后，測(cè)定其HPLC效價(jià)。

1.2.5 傳代穩(wěn)定性驗(yàn)證 將保藏的4株單菌落斜面進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳三代，待斜面培養(yǎng)成熟后進(jìn)行搖瓶驗(yàn)證。同復(fù)篩驗(yàn)證方法，連續(xù)驗(yàn)證2批。對(duì)照組同1.2.4.3項(xiàng)。比較并分析其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值，判斷其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)的觀察 從不同平板培養(yǎng)基上選擇不同類(lèi)型菌落進(jìn)行記錄，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的菌落表面干燥，外觀形態(tài)大而疏松，菌絲相互交織，粗而分化，菌落不透明，菌落與培養(yǎng)基之間粘合牢固，較難研磨，培養(yǎng)11～12 d可以挑取單菌落，培養(yǎng)11 d時(shí)單菌落外觀形態(tài)見(jiàn)圖1。對(duì)照組麥芽浸膏培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的菌落表面干燥，但菌落的外觀形態(tài)較小而致密，菌絲相互交織，粗而分化，菌落不透明，菌落與培養(yǎng)基之間粘合牢固，比較好研磨，培養(yǎng)13～14 d可以挑取單菌落，培養(yǎng)11 d時(shí)單菌落外觀形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖2 麥芽浸膏培養(yǎng)基平板11 d菌落形態(tài)

圖1 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板11 d菌落形態(tài)

2.2 初篩驗(yàn)證結(jié)果 從馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上挑取86株單菌落，擴(kuò)培到麥芽浸膏培養(yǎng)基上制成斜面，經(jīng)搖瓶初篩驗(yàn)證有11株效價(jià)高于對(duì)照，高效價(jià)菌株占總挑選數(shù)的12.8%;同時(shí)從麥芽浸膏培養(yǎng)基上挑取77株單菌落，擴(kuò)培到麥芽浸膏培養(yǎng)基上制成斜面，經(jīng)搖瓶初篩驗(yàn)證有5支效價(jià)高于對(duì)照，高效價(jià)菌株占總挑選數(shù)的6.5%。根據(jù)初篩驗(yàn)證效價(jià)，挑選出馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基選育的8支效價(jià)較高的菌株 2107、2115、2154、2165、2183、2189、2201、2216和麥芽浸膏培養(yǎng)基選育的4支效價(jià)較高的菌株 2253、2262、2283、2289 進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證。

2.3 復(fù)篩驗(yàn)證結(jié)果 如表1所示，從復(fù)篩效價(jià)分析，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上選育的8支菌株，其復(fù)篩驗(yàn)證效價(jià)均高于麥芽浸膏培養(yǎng)基上選育的4支菌株，且高于對(duì)照組，經(jīng)過(guò)兩次復(fù)篩搖瓶驗(yàn)證，將2107、2115、2165、2183 共 4 支單菌落斜面用液體石蠟覆蓋保藏。

表1 復(fù)篩驗(yàn)證結(jié)果 U/mL

2.4 篩選菌株穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果 從表2中的數(shù)據(jù)可以得出，2107、2115、2165和2183共4支菌株的第三代傳代斜面其驗(yàn)證效價(jià)均高于出發(fā)株斜面(對(duì)照)，而且RSD值較小，說(shuō)明這4支菌株傳代穩(wěn)定性較好。

表2 穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

3 討論

3.1 自然選育作為菌種選育中的一種重要手段，具有顯著的優(yōu)勢(shì)，其操作簡(jiǎn)單，可通過(guò)肉眼觀測(cè)以及測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物成分即可選育出效價(jià)高的菌株，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作為常見(jiàn)的真菌培養(yǎng)基，搖瓶驗(yàn)證表明馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基適用于延胡索酸泰妙菌素產(chǎn)生菌的生長(zhǎng)。通過(guò)涂布法將TMⅡ10-444菌株分離在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和麥芽浸膏培養(yǎng)基上，置于同一生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察其生長(zhǎng)情況并記錄菌株生長(zhǎng)過(guò)程，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基可以使菌種的生長(zhǎng)周期從麥芽浸膏培養(yǎng)基上的14 d縮短到11 d，有效地縮短了選育周期，提高了選育的效率。

3.2 對(duì)于生產(chǎn)的菌種而言，其穩(wěn)定性必須得到保證，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基所選育的菌種傳代培養(yǎng)結(jié)果顯示穩(wěn)定性表現(xiàn)良好，并且比正常生產(chǎn)的搖瓶效價(jià)高，初步表明其可用于生產(chǎn)。

3.3 由于麥芽浸膏在培養(yǎng)基中的用量大、價(jià)格昂貴，極大地增加了生產(chǎn)成本;而馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基使用的原料主要為馬鈴薯、葡萄糖等，成本較低，而且選育周期比麥芽浸膏培養(yǎng)基縮短3～4 d，綜合比較，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基具有一定的優(yōu)勢(shì)，其可以成為延胡索酸泰妙菌素產(chǎn)生菌菌種選育的一種新方法。

[1]鄒 懿，黃宇琪，胡昌華.截短側(cè)耳素及其衍生物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)抗生素雜志，2009，34(2):65-68.

[2]董洪梅，王新風(fēng).PDA培養(yǎng)基的微波滅菌研究[J].北方園藝，2005，(1):71-72.