重組hcmvIL-10的表達純化及免疫抑制活性研究①

曾 智 高 艷 馮晶晶 田可港 浮 苗 彭 穎 鄭曉群

(溫州醫學院附屬第二醫院，溫州325027)

人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)是皰疹病毒科β屬雙股線性DNA病毒。發達國家人群HCMV的感染率為40% ～60%，而發展中國家幾乎達到100%，且多在嬰幼兒時期發生[1]。HCMV是胎兒宮內感染和圍產期感染的重要病原，也是引起嬰幼兒和免疫力低下個體的主要病原體之一。HCMV感染具有潛伏-激活的生物學特性，其侵入人體后可通過多種途徑逃避宿主的免疫監視和防御功能，在體內潛伏或呈低度復制，從而長期或終身存在于宿主體內。

HCMV自身可編碼多種蛋白，從多個水平干擾宿主的免疫應答，或調節病毒DNA的復制，有利于宿主細胞內潛伏。研究表明[2]，HCMV病毒基因組中存在與人類白細胞介素10(Interleukin-10，IL-10)序列同源性的區域，編碼IL-10同源類似物，即人巨細胞病毒編碼的IL-10同源類似物(hcmvIL-10)。hcmvIL-10與人白細胞介素10(hIL-10)有27%同源性，可與 IL-10 受體(IL-10R)相互作用[3，4]，具有 IL-10的許多重要功能:如抑制細胞因子的合成，干擾細胞表面MHC的表達和調節細胞介導的細胞毒性反應等[5]。因此，為了研究 hcmvIL-10在HCMV潛伏-激活感染中的作用機制及其與hIL-10的功能差異，我們表達純化了hcmvIL-10和hIL-10重組蛋白，探討并比較二者對單核細胞的免疫抑制活性及分化相關基因表達的差異，為進一步深入研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pMal-c2X-hcmvIL-10和pMal-c2X-hIL-10菌株由本實驗室保存;THP-1細胞購自中國科學院上海細胞庫;蛋白質分子量標準(低)、100 bp DNA Ladder Marker、PCR 試劑、RT-PCR試劑盒、QPCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司;功能分類Th1-Th2-Th3 PCR ARRAY購自美國Super-Array公司(PAHS-034A);β-巰基乙醇(2-ME)購自美國Gibco公司;Amylose柱及抗MBP抗體購自美國NEB公司;Trizol Reagent、DEPC水購自上海捷瑞生物工程有限公司;ELISA試劑盒購自北京四正柏生物技術有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)、二甲基亞砜(DMSO)、雙抗(青霉素/鏈霉素)、細胞培養板、培養皿、羊抗兔HRP-IgG抗體、DAB顯色試劑盒購自碧云天生物技術研究所;蛋白質預染Marker購自Fermentas公司;RPMI1640培養液購自Hyclone公司;特級胎牛血清購自天津TBD公司;Anti-Human HLA-DR PE、Mouse IgG2b κ Isotype Control PE購自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 重組hcmvIL-10的誘導表達及純化 將重組表達質粒pMal-c2X-hcmvIL-10(同時構建hIL-10重組表達質粒pMal-c2X-hIL-10作為實驗對照，本實驗室已構建)轉化受體菌E．coli BL21(DE3)中，以含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板篩選，37℃培養過夜，經IPTG誘導表達目的蛋白。表達條件的優化:分別采用不同IPTG 終濃度(0.05、0.1、0.5、1 mmol/L)，不同時間(1、3、5、7 小時)進行誘導表達，收集細菌沉淀超聲破碎，進行SDS-PAGE電泳，比較不同條件下融合蛋白表達情況，以選擇最佳的誘導條件。

離心收集誘導表達的菌體，超聲破碎后，取上清用Amylose-resin親和層析對含MBP標簽的蛋白進行初步純化。根據分子量的大小采用葡聚糖凝膠(Sephadex G-75)層析進行二次純化，并經 SDS

PAGE電泳鑒定。

1.2.2 重組蛋白的Western blot鑒定 將純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳，轉膜后加入(1∶1 000)的抗MBP抗體4℃過夜，洗膜后加(1∶1 000)的 HRP-羊抗鼠IgG于室溫溫育1小時，再次洗膜后以DAB試劑盒進行顯色。

1.2.3 細胞培養上清液TNF-α檢測 取對數生長期THP-1細胞，計數后鋪板，使細胞密度為0.5×106ml-1，每孔加1 μl PHA，然后加入重組 hcmvIL-10和hIL-10使其終濃度分別為0、2、10和50 ng/ml，于37℃、5%CO2培養箱培養48小時后，收集細胞培養液，1 000 r/min×10分鐘離心去除顆粒和聚合物。每個樣品設2個復孔，每孔加100 μl上清液，37℃孵育90分鐘后，洗滌4次;加生物素化抗體工作液(100 μl/孔)，37℃ 孵育 60 分鐘，洗滌 4 次;加酶結合工作液(100 μl/孔)，37℃孵育30分鐘，洗滌4次;加顯色劑100 μl/孔，避光，37℃孵育20分鐘后，加終止液100 μl/孔，混勻后測量OD450值。根據標準曲線計算出樣品中TNF-α含量，實驗重復3次。

1.2.4 THP-1細胞HLA-DR表達檢測 取對數生長期THP-1細胞，計數后鋪板，使細胞密度為0.5×106ml-1，每孔加重組hcmvIL-10和hIL-10使其終濃度分別為0、2、10、50 ng/ml，于37℃、5%CO2培養箱培養48小時后，提取細胞總RNA，實時熒光PCR檢測HLA-DR mRNA表達。具體步驟:將孔中的THP-1細胞移入1.5 ml離心管，1 000 r/min離心5分鐘，吸去上清，沉淀PBS洗滌3次;每管加Trizol Reagent 1 ml，混勻后室溫放置5分鐘，加200 μl氯仿，振蕩混勻，室溫放置5分鐘，10 000 r/min×15分鐘4℃離心;取上清，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘，10 000 r/min×10分鐘4℃離心;向沉淀中加入75%乙醇清洗沉淀，10 000 r/min×5分鐘4℃離心，棄上清，保留沉淀風干;將沉淀溶解于20 μl DEPC水中待用。HLA-DR上游引物:5'-TTGTCTGTTCTGCCTCACTCC-3'，下游引物:5'-GTCAGGATTCAGATAGAACTCGG-3'，擴增片段長度 186 bp;內參GAPDH上游引物:5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游引物:5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG3'，擴增片段長度185 bp。20 μl反應體系含10 μl SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、正反向引物各0.4 μl(20 μl/L)、2 μl cDNA ，加水補充到 20 μl。PCR反應條件:95℃預變性30秒后，95℃變性5秒，56℃退火20秒，72℃延伸40秒，共40個循環。采用2-ΔΔCt方法，以GAPDH為內參，分析基因的相對表達量。同時，另收集上述作用48小時后THP-1細胞，1 000 r/min離心5分鐘，每管加2 ml PBS緩沖液洗滌一次，同型對照組加5 μl Mouse IgG2b κ Isotype Control PE，實驗組加5 μl Anti-Human HLA-DR PE，輕輕混勻，避光30分鐘，每管分別加2 ml PBS緩沖液洗滌細胞一次，再加200 μl PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞表面HLA-DR的表達。

1.2.5 采用功能分類PCR ARRAY檢測相關基因表達譜 取對數生長期THP-1細胞，計數后鋪板，使細胞密度為0.5×106ml-1，每孔分別加重組載體、hcmvIL-10和hIL-10蛋白使其終濃度為50 ng/ml，于37℃、5%CO2培養箱培養 48 小時后，收集THP-1細胞提取總RNA，DNaseⅠ 消化RNA樣品，去除其中可能含有的基因組DNA，再次純化RNA并檢測質量，合成cDNA，采用功能分類 Th1-Th2-Th3 PCR ARRAY檢測84個基因表達量。具體操作及數據分析由上海康成生物工程有限公司完成。

1.3 統計學分析 用SPSS15.0軟件進行統計分析。各組檢測實驗數據經方差齊性檢驗，符合正態分布，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組蛋白的表達純化及Western blot鑒定37℃分別用0.05、0.1、0.5和 1.0 mmol/L IPTG 誘導表達1、3、5和7小時，表達產物經SDS-PAGE電泳分析，結果顯示0.5 mmol/L IPTG在37℃ 誘導5小時能有效地誘導重組蛋白的表達，pMal-c2X的MBP標簽大小約為42.4 kD，hcmvIL-10和hIL-10蛋白的大小分別約為20.1 kD和19.7 kD，加上MBP標簽的大小，結果與預期吻合(圖1)。重組菌經超聲(3秒，15秒，54次)裂解后，12 000 r/min離心10分鐘，經SDS-PAGE電泳分析，產物主要存在于菌體超聲破碎物離心后的上清和沉淀中，利用Amyloseresin親和層析柱對含MBP標簽的蛋白進行純化，葡聚糖凝膠G-75(Sephadex G-75)層析進行二次純化，并由SDS-PAGE電泳分析(圖2)。Western blot鑒定可見在大約62.5 kD和62.1 kD處有兩條特異性蛋白條帶(圖3)。

2.2 重組蛋白對PHA誘導THP-1細胞分泌TNF-α的影響 對照組PHA誘導THP-1細胞分泌TNF-α量為(4.20±0.40)pg/ml;不同濃度(2、10、50 ng/ml)重組 hcmvIL-10和 hIL-10作用 PHA誘導的THP-1細胞48小時后，培養上清液中TNF-α濃度分別為:(3.8±0.96)pg/ml、(1.95±0.51)pg/ml、(1.6±0.45)pg/ml和(2.49±0.43)pg/ml、(1.77±0.38)pg/ml、(0.98±0.16)pg/ml，較對照組明顯下降(圖4)，除2 ng/ml hcmvIL-10處理組差異無統計學意義(P＞0.05)，其余各組差異均有統計學意義(P＜0.01)。結果表明，重組hcmvIL-10能抑制THP-1細胞分泌TNF-α，隨著濃度的增高，抑制作用增強，類似hIL-10的抑制功能。

圖1 純化重組子在大腸桿菌BL21中表達和親和層析純化產物SDS-PAGE電泳分析Fig．1 Expression of purified recombinant in E．coli BL21 and SDS-PAGE electrophoresis analysis of product purified by affinity chromatography

圖2 重組蛋白純化后SDS-PAGE電泳分析Fig．2 SDS-PAGE electrophoresis analysis of recombinant purified protein

圖3 重組蛋白Western blot鑒定圖Fig．3 Identification of recombinant protein with Western blot

圖4 不同濃度重組蛋白對PHA誘導THP-1細胞分泌TNF-α的抑制作用Fig．4 Inhibitiory effect of different concentrations recombinant protein on the TNF-α secretion from THP-1 cells induced by PHA

2.3 重組蛋白對THP-1細胞HLA-DR表達的影響不同濃度(2、10、50 ng/ml)重組 hcmvIL-10、hIL-10與THP-1細胞作用48小時后，THP-1細胞HLADR mRNA相對表達量分別為:0.86±0.025、0.76±0.023、0.75±0.017和0.73±0.017、0.61±0.017、0.55±0.015;HLA-DR分子的表達分別為:(11.5±0.44)%、(10.1±0.30)%、(9.1±0.38)%和(10.9±0.10)%、(9.7±0.50)%、(7.5±0.32)%，與對照組比較，除2 ng/ml重組hcmvIL-10處理組HLA-DR分子表達差異無統計學意義(P＞0.05)，其它處理組差異均具有顯著統計學意義(P＜0.01，圖5、6)。結果表明，重組hcmvIL-10能下調THP-1細胞HLADR的表達，隨著hcmvIL-10濃度的增高，抑制THP-1細胞HLA-DR表達作用增強，與 hIL-10的功能相似。

圖5 不同濃度重組蛋白對THP-1細胞HLA-DR mRNA的抑制作用Fig．5 Inhibitiory effect of different concentrations recombinant protein on HLA-DR mRNA of THP-1 cells

圖6 不同濃度重組蛋白對THP-1細胞表面HLA-DR的抑制作用Fig．6 Inhibitiory effect on THP-1 cells surface HLADR by recombinant protein at different concentrations

2.4 重組蛋白對THP-1細胞相關基因表達的影響不同重組蛋白(載體、hIL-10和hcmvIL-10蛋白，終濃度為50 ng/ml)與THP-1細胞作用48小時后，分別采用功能分類Th1-Th2-Th3 PCR ARRAY檢測84個基因表達量，以重組載體蛋白為對照，Fold絕對值≥2為差異具有統計學意義。結果顯示:重組hcmvIL-10與hIL-10對THP-1細胞相關基因的表達存在差異。hcmvIL-10處理組共有8個基因差異表達，上調基因為 IL-12RB2、NFATC2、SOCS2、TYK2、GFI1和CEBPB，下調基因為CD80和CTLA4;hIL-10處理組共有5個基因差異表達，上調基因為SOCS2，下調基因為 CD80、CD28、CTLA4 和 IL-6(見表1)。

3 討論

病毒在與人類共同進化的過程中產生了大量的基因編碼產物，介入感染宿主的多項生命活動，其目的在于幫助病毒逃避宿主的免疫攻擊，為病毒在宿主細胞中繁殖和復制創造有利的微環境。HCMV病毒基因組中存在與人IL-10序列同源性的區域，編碼IL-10同源類似物(hcmvIL-10)，可與IL-10受體(IL-10R)相互作用，具有 IL-10的許多重要功能[4，5]。既往研究顯示 hcmvIL-10 與 IL-10R 相互作用可能是病毒實現免疫逃避的重要策略，但hcmvIL-10在病毒潛伏-激活感染中的具體作用及與hIL-10的功能差異仍不明確。

表1 重組蛋白對THP-1細胞相關基因表達的影響Tab．1 The effection of recombinant protein on THP-1 cell associated genes expression

重組蛋白的表達根據目的不同，可選擇可溶性表達或以包涵體形式表達。pMal-c2x載體表達的融合蛋白是可溶性表達，所以無需進行復性，使純化過程更為簡單。由于目的蛋白在構建表達載體時，含有編碼麥芽糖結合蛋白質(MBP)的大腸桿菌malE基因，在其下游將目的基因插入，從而表達含有MBP的融合蛋白質，通過Amylose親和層析柱進行純化，純化后蛋白濃度非常高，同時選用葡聚糖凝膠G-75進行二次純化，滿足后續蛋白功能方面的研究。

TNF-α是一種具有廣泛生物活性的多功能細胞因子，主要由被激活的巨噬細胞或單核細胞產生，是機體炎癥反應和免疫應答的重要調節因子，并參與多種生理和免疫過程。HLA-DR編碼MHCⅡ類分子，主要表達于B細胞、單核巨噬細胞和樹突狀細胞等抗原遞呈細胞上，在免疫應答的始動階段將經過處理的抗原片段遞呈給CD4+T細胞。HCMV感染宿主細胞后，MHCⅡ類分子表達下調將導致CD4+T細胞監視感染細胞的能力受損，有利于病毒長期潛伏于宿主細胞內。本研究顯示重組hcmvIL-10能不同程度的抑制PHA誘導的THP-1細胞分泌TNF-α，并下調THP-1細胞HLA-DR的表達。實驗結果表明，我們表達的蛋白對單核細胞的免疫抑制活性及分化相關基因表達具有一定的調節作用，且在生物學功能上與hIL-10有一定程度的相似性，這可能對HCMV實現免疫逃避和持續感染有著非常重要的作用。

研究表明hcmvIL-10除了能抑制炎性細胞因子的合成，降低MHCⅡ類分子的表達外，它還能干擾樹突狀細胞(DC)的成熟及其抗原提呈能力，使得DC共刺激分子 CD40、CD80和CD86等的上調受損[6-8]。我們通過PCR ARRAY檢測了重組hcmvIL-10與THP-1細胞作用后相關基因表達譜，結果顯示，重組hcmvIL-10能明顯下調CD80和CTLA4基因表達，同時明顯上調 IL-12RB2、NFATC2、SOCS2、TYK2、GFI1和CEBPB基因表達;hIL-10明顯下調CD80、CD28、CTLA4和 IL-6基因表達，上調 SOCS2基因表達。CD80和CD28屬于免疫細胞活化基因，參與激活T細胞，介導協同刺激信號;SOCS2屬細胞因子信號轉導抑制因子，由細胞因子誘導產生，JAK-STAT信號通路中非常重要的負調控蛋白，通過與細胞因子受體結合來抑制細胞因子信號轉導[9，10]，調節機體對細胞因子的過渡刺激，可抑制巨噬細胞或樹突狀細胞的激活;GFI1即獨立生長因子，是一種T淋巴細胞特異的轉錄抑制因子[11]。研究結果表明，重組hcmvIL-10可能通過下調CD80和CD28基因表達，上調SOCS2和GFI1基因表達，抑制THP-1細胞的免疫功能。NFAT即活化T細胞核因子，是一類具有多向調節功能的轉錄因子，參與T細胞的活化過程，在Th0細胞的分化中起重要作用，調節Th2細胞因子的產生。NFAT參與T細胞耐受，在免疫無能T細胞中，NFAT信號途徑對T細胞活化起負調節作用，下調T細胞表面受體信號傳遞，抑制細胞因子的產生[12，13]。CEBPB 屬增強子結合蛋白，與NFAT有正協同作用[14]。本研究發現，重組hcmvIL-10能顯著上調NFATC2和CEBPB的表達，NFATC2表達差異達5.73倍，而hIL-10作用不明顯。由此可見，重組蛋白hcmvIL-10作用THP-1細胞后基因表達情況與hIL-10存在差異，引起這些差異的原因可能是:hcmvIL-10雖是hIL-10的同源類似物，但其二者在序列和結構上仍存在一定差別，如hcmvIL-10與hIL-10有27% 同源性，為非連續性片段，位于HCMV病毒ULlll.A基因附近，有3段外顯子和2個內含子，這可能導致二者在與受體結合及誘導下游信號通路方面存在差異。

綜上所述，重組hcmvIL-10具有一定的生物學活性，能不同程度的抑制THP-1細胞HLA-DR的表達及分泌TNF-α，與hIL-10有很大的相似性。雖然hcmvIL-10和hIL-10在結構和功能上有很大的相似性，但二者引起THP-1細胞中基因表達變化存在差異，進一步通過對這些差異基因的作用及其機制進行研究，有助于HCMV潛伏-激活感染機制的闡明。

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