人乳腺癌疫苗HSP65-HER2聯用CpG684的抗腫瘤作用

吳秀麗 顏游游 宋丹丹 付 堯 華 立 王麗穎 王 華

(吉林大學白求恩醫學院分子生物學系，長春130021)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其中大約25%～30%的浸潤性乳腺癌過量表達人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor2，HER2)，與乳腺癌病人在短時間內的復發和生存期的縮短有關[1，2]。而 HER2在正常組織中低表達，使HER2成為治療HER2陽性乳腺癌理想的靶點，很多應用HER2全長或HER2表位構建的腫瘤疫苗已經應用到臨床前及臨床研究[3，4]。本實驗室根據熱休克蛋白65(Heat shock protein 65，HSP65)具有交叉提呈抗原作用將外源性抗原通過MHCⅠ類途徑特異性地呈遞給CD8+T細胞的功能，構建了包含HSP65與多個HER2 CTL表位的融合蛋白(HSP65-HER2)并初步在體外實驗中驗證了其抗腫瘤活性[5]，但沒進一步驗證其在體內的抗腫瘤活性。

CpG ODN作為腫瘤疫苗的佐劑可增強腫瘤抗原的免疫原性，誘導出強大的Th1和CTL型免疫反應，增強腫瘤疫苗的抗腫瘤效果[6]。本研究以小鼠HER2陽性黑色瘤為模型，選用本室自行設計的CpG684作為HSP65-HER2的佐劑，驗證二者聯用在機體內的抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI1640干粉培養基，新生牛血清，胰蛋白酶均購于Gibco，CpG684由大連寶生物工程有限公司合成。HSP65-HER2蛋白由本科室構建表達后，凍干保存。

1.2 實驗動物和細胞株 C57BL/6雌性小鼠，6～8周齡，由吉林大學動物實驗中心提供，轉染pcDNA3-GFP-HER2質粒的小鼠黑色瘤細胞株(HER2+B16)來自吉林大學分子生物學實驗室[7]。

1.3 動物實驗 把C57BL/6雌性小鼠，隨機分成3組，每組10只，分別為PBS陰性對照組，CpG684對照組，HSP65-HER2聯用CpG684免疫組。免疫流程:小鼠左右腹股溝皮下注射100 μl/只，CpG684的用量為 10 μg/只，HSP65-HER2的用量為 1 μg/只，每隔1周注射1次，共3次。在免疫結束后第4天，將制備的HER2+B16腫瘤細胞懸(0.75×105/只)接種到小鼠腹腔，并檢測小鼠的生存期。

2 結果

2.1 HSP65-HER2蛋白鑒定 SDS-PAGE電泳鑒定HSP65-HER2蛋白樣品(見圖1)。

圖1 HSP65-HER2的SDS-PAGE分析Fig．1 Analysis of HSP65-HER2 by SDS-PAGE

圖2 小鼠生存期Fig．2 Survival of mice

2.2 小鼠的生存期 生存期結果表明免疫了HSP65-HER2和CpG684的小鼠生存期明顯延長，接種腫瘤70天后仍有80%的小鼠存活，而CpG684對照組僅有10%小鼠存活(P＜0.01)，PBS對照組無小鼠存活(P＜0.01)。見圖2。

3 討論

由于腫瘤抗原是弱抗原，而熱休克蛋白具有交叉提呈外源性抗原通過MHCⅠ類途徑提呈給CD8分子，并具有一定非特異性刺激作用，很多實驗室將熱休克蛋白和腫瘤抗原融合制備腫瘤疫苗[8]。大量實驗研究表明熱休克蛋白和腫瘤抗原融合蛋白疫苗在動物實驗中都取得了良好的抗腫瘤效果，但是在臨床實驗中的治療效果不夠理想，至今還沒有一種熱休克蛋白相關性的腫瘤疫苗被批準應用于臨床實踐[9]。這可能是由于熱休克蛋白的免疫刺激作用還不足以打破腫瘤導致的免疫耐受。為了使HSP65-HER2發揮更好的抗腫瘤效果，我們聯用了CpG684作為疫苗佐劑。CpG684是我們實驗室自行設計的CpG ODN，其作為狂犬疫苗佐劑時顯著提高了抗體的產生并使誘導更強的Th1反應，而Th1類反應可以發揮更好的抗腫瘤效果[10]。

實驗結果表明免疫了HSP65-HER2和CpG684激發的免疫應答對于HER2+B16腫瘤的攻擊起到有效的保護作用，荷瘤小鼠的生存期顯著延長(P＜0.01)。這種保護性的免疫應答可能是以細胞免疫應答為主，這是由于該實驗小鼠腫瘤模型中所用的HER2+B16細胞表達的HER2蛋白沒有跨膜區，細胞表面缺乏HER2的靶點。此外HSP65-HER2多選用HER2的CTL表位，所以該疫苗激發的免疫反應主要是CTL為主。該研究表明HSP65-HER2聯用CpG684發揮了明顯的抗腫瘤效果，為進一步研究治療HER2陽性乳腺癌的策略提供新的研究思路。

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7 李 賀，向澤敏，吳秀麗et al．體內穩定表達HER2多表位基因B16細胞系的建立[J].細胞與分子免疫學雜志，2009;25(1):13-15.

8 Wang H H，Mao C Y，Teng L S et al．Recent advances in heat shock protein-based cancer vaccines[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2006;5(1):22-27.

9 De Gruijl T D，van den Eertwegh A J，Pinedo H M et al．Whole-cell cancer vaccination:from autologous to allogeneic tumorand dendritic cell-based vaccines [J].Cancer Immunol Immunother，2008;57(10):1569-1577.

10 Wang X，Bao M，Wan M et al．A CpG oligodeoxynucleotide acts as a potent adjuvant for inactivated rabies virus vaccine[J].Vaccine，2008;26(15):1893-1901.