小膠質細胞在不同損傷神經環境下CD200R的表達①

張吉娟 羅曉光 馮 昱 禹紅梅 任 艷 何志義

(中國醫科大學附屬第一醫院神經內科，沈陽110001)

小膠質細胞是中樞神經系統中最具有代表性的免疫細胞。自1891年首次描述小膠質細胞以來，其在中樞神經系統中的作用越來越受到人們的重視。小膠質細胞在帕金森病、阿爾茲海默病及腦部炎癥、缺血等多種神經系統病變中發揮著損傷和修復的雙重作用[1-3]。最新研究顯示CD200-CD200R通路是中樞神經系統內下調小膠質細胞活化的重要機制[4]。CD200與CD200R結合觸發細胞內信號級聯放大系統功能，控制并下調單核巨噬細胞系統的活化。CD200是一種跨膜表達的糖蛋白，表達范圍較廣，主要在神經細胞、胸腺細胞、B細胞、T細胞、血管內皮細胞等[5]。其受體為CD200R，主要表達在單核巨噬細胞系統和少量的T細胞上，具有與其配體CD200非常相似的結構[6]。CD200與 CD200R結合觸發細胞內信號級聯放大的系統功能，控制并下調單核巨噬細胞系統的活化[7]。

本實驗以鼠小膠質細胞瘤細胞(BV2)和鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)細胞株分別代替小膠質細胞和神經細胞進行傳代培養，考察小膠質細胞(BV2)在不同損傷神經環境下CD200R的表達情況。結果發現小膠質細胞(BV2)與損傷神經細胞(PC12)共育后，小膠質細胞CD200R表達增多，細胞狀態良好。小膠質細胞與受損神經元之間的直接接觸和二者之間的雙向交流對于小膠質細胞的CD200R表達至關重要。

1 材料與方法

1.1 PC12及BV2培養及傳代 PC12及BV2分別種于PC12培養基(5% 胎牛血清1640，均購自Hyclone公司，美國)及BV2培養基(含10% 胎牛血清DMEM，Hyclone公司，美國)中，其中PC12呈半懸浮狀態生長，傳代7～8次后，轉為貼壁生長。BV2為貼壁細胞。至細胞生長良好時開始實驗。

1.2 實驗過程及分組

1.2.1 實驗過程 以終濃度為500 nmol/L RT損傷PC12細胞，12小時后換新鮮1640培養液，再過12小時后收取上清及PC12細胞;損傷PC12上清與新鮮1640培養液以1∶3的比例用來培養BV2細胞;每孔收集的PC12細胞分成3等份分別與BV2細胞共育。正常培養的PC12細胞培養12小時后收取細胞及上清液，以上述比例用于試驗。

1.2.2 具體分組 A、BV2以普通1640孵育作對照;B、BV2以正常PC12上清孵育;C、BV2以受損PC12上清孵育;D、BV2與正常PC12細胞共育;E、BV2與受損PC12細胞共育。

以孔板培養皿和相應尺寸的轉移篩網建立兩種細胞的共育培養系統，轉移篩網孔徑8 μm，能允許轉移篩網內外的大分子蛋白和液體交流，但不允許細胞通過。共育結束后移走轉移篩網及其上細胞，對培養皿上的細胞進行單獨檢測。每組檢測時重復3～5次。

1.3 MTT檢測 BV2細胞分別與正常的PC12細胞、RT預處理的PC12細胞共育培養及用正常和損傷的PC12上清孵育、正常1640培養作對照。培養24小時，重復3孔，每組至少重復3次。兩種細胞的共育培養用轉移篩網(孔徑8 μm的transwell)間隔。移走PC12及轉移篩網，檢測時每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，繼續培養4小時，棄上清。每孔加入150 μl DMSO，震蕩10分鐘后，酶標儀570 nm波長下自動測OD值。細胞存活率(%)=處理組細胞OD/對照組細胞OD×100%。

1.4 倒置熒光顯微鏡檢測 細胞分別與正常的PC12細胞、RT預處理的PC12細胞共育培養及用正常和損傷的PC12上清孵育、正常1640培養作對照。培養24小時，重復3孔，每組至少重復3次。兩種細胞的共育培養用轉移篩網(孔徑8 μm的transwell)間隔。移走 PC12及轉移篩網，去上清，PBS漂洗1次，4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，PBS漂洗1次，抗CD200R一抗孵育4℃過夜，PBS漂洗3次，熒光二抗室溫孵育1～2小時，PBS漂洗3次，鏡下觀察BV2。

1.5 ELISA檢測CD200R蛋白表達 BV2細胞分別與正常的PC12細胞、RT預處理的PC12細胞共育培養及用正常和損傷的PC12上清孵育、正常1640培養作對照。培養24小時，重復3孔，每組至少重復3次。兩種細胞的共育培養用轉移篩網(孔徑8 μm的transwell)間隔。移走PC12及轉移篩網，去上清，PBS輕洗1遍。4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，PBS輕洗 1遍，PBS 1×(1%BSA、0.1%Triton)固定1 小時，加入 CD200R(1∶300)40 μl每孔，4℃過夜，PBS 洗3 次，加入 Hrp二抗(1∶2 500)，每孔40 μl，變色后加入 40 μl H2SO4，震蕩 10 分鐘后，酶標儀450 nm波長下測OD值，測出的OD值因受細胞數量的影響，需要與細胞存活率進行標準化，即ELISA OD值/細胞存活率，然后再進行分析比較。

2 結果

2.1 MTT實驗結果 與正常對照組相比，正常神經細胞上清孵育組及損傷神經細胞上清孵育組OD值顯著降低(P＜0.05)，細胞存活率下降，正常神經細胞共育組及損傷神經細胞共育組與正常對照組相比，OD值略高，但無統計學意義(P＞0.05)，細胞存活率無顯著差異 (見表1，圖1)。

2.2 倒置熒光顯微鏡觀察結果 普通倒置顯微鏡下可見，正常BV2細胞單層生長，細胞體呈細長或橢圓，從胞體發出細長而有分支的突起，表面有許多小棘突，胞體飽滿，細胞數量多，細胞間聯系緊密，相互交織成簇狀。D、E組與正常BV2細胞形態一致。B、C組細胞數量減少，貼壁細胞由原來細長或橢圓變小、變圓，細胞突觸變短、甚至消失，細胞之間連接消失，核固縮，胞漿腫脹，胞膜尚完整。

表1 不同損傷神經環境下BV2細胞的存活率(%)Tab．1 The survival rate of BV2 cells under different injury nerve environments(%)

圖1 不同損傷神經環境下BV2細胞的存活率(%)Fig．1 The survival rate of BV2 cells under different injury nerve environments(%)

圖2 不同損傷神經環境下BV2細胞CD200R的表達情況Fig．2 The expression of CD200R on BV2 cells under different injury nerve environments

熒光鏡下見CD200R陽性細胞呈紅色熒光，A、D、E組熒光明顯，尤以E組突出。B、C組熒光較弱，C組熒光斷續，部分消失(如圖2)。

2.3 ELISA檢測CD200R蛋白表達 經標準化后，與正常對照組(A組)相比，損傷神經細胞上清孵育組(C組)OD值顯著降低(P＜0.05)，細胞CD200R表達減少;損傷神經細胞共育組(E組)OD值顯著升高(P＜0.05)，細胞CD200R表達增加。正常神經細胞上清孵育組(B組)，正常神經細胞共育組(D組)與對照組相比無顯著差異(P＞0.05)。如表2、圖3。

3 討論

神經元不僅僅是受小膠質細胞調節的對象，它也能夠調控小膠質細胞的活化[8]。而神經元和小膠質細胞的相互作用主要是通過CD200-CD200R信號通路完成的，它在調控小膠質細胞的活化中起到了關鍵的作用[9]。本實驗結果發現，無論與正?；蚴軗p的PC12共育，BV2細胞存活率與對照組無明顯變化，而且與受損的PC12共育顯著提高了BV2細胞CD200R的表達。此外，我們也看到無論是正常還是受損的PC12上清都可以影響BV2細胞的存活率，并且受損的上清使BV2的CD200R表達減少。提示小膠質細胞與受損神經元的直接接觸和與神經元之間蛋白遞質的雙向交流對于小膠質細胞存活、活化和發揮生物學功能有很重要的影響。有實驗結果顯示[10]與損傷PC12直接共育的BV2顯著提高了骨髓間充質細胞的神經營養功能，表現為以該骨髓間充質細胞培養上清液溫育受損PC12后，PC12的凋亡同對照組相比顯著減少，而與健康PC12共育的BV2一定程度上也提高了骨髓間充質細胞的神經營養功能。提示神經元的損傷是小膠質細胞對骨髓間充質細胞神經營養功能施加良性影響的重要條件。聯系本實驗，小膠質細胞可能是通過CD200R發揮神經營養功能。本實驗支持了小膠質細胞的活化受神經元的影響，并且在神經變性病的早期神經元通過CD200/CD200R信號系統抑制小膠質細胞活化的能力更強，損傷神經元較遠處的小膠質細胞CD200R表達低，可能表明處于較強的激活狀態，而受損神經細胞附近的小膠質細胞則有可能受到有效調控，提高CD200R表達，炎癥得到有效控制。

表2 標準化后的各組OD值Tab．2 Groups OD after standardization

圖3 各組CD200R的表達Fig．3 The expression of CD200R

因此，以CD200-CD200R為靶點調控小膠質細胞有望成為神經系統疾病研究領域的新方向。從這條途徑出發較現行其他途徑可能更有前途，因為以CD200-CD200R為靶點調控小膠質細胞不僅考慮到小膠質細胞激活對神經元的毒性作用，也考慮到神經元對小膠質細胞的作用，較現行的其他研究更符合機體內部的規律，以保證機體完成復雜精確的信息傳遞。對CD200-CD200R信號系統的深入研究，可能為探討神經系統疾病的發病機制及治療提供新的線索。

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3 Jens Neumann，Matthias Gunzer，Gutzeit H O et al．Microglia provide neuroprotection after ischemia[J].FASEB，2006;20:714-716.

4 Sastre M，Klockgether T，Heneka M T.Contribution of inflammatory processes to Alzheimer's disease:molecular mechanisms[J].Int J Dev Neurosci，2006;4(2-3):167-176.

5 Teismann P，Tieu K，Cohen O et al．Pathogenic role of glial cells in Parkinson's disease[J].Mov Disord，2003;18(2):121-129.

6 Launer L.Nonsteroidal anti-inflammatory drug use and the risk for Alzheimer's disease:dissecting the epidemiological evidence[J].Drugs，2003;63(8):731-739.

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8 Combs C K，Karlo J C，Kao S C.beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNFalpha-dependent expression of inducible nitric oxide synthase and neuronal apoptosis.[J].Neurosci，2001;21(4):1179-1188.

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10 羅曉光，葛春林，任 艷.與損傷神經細胞共育后小膠質細胞促進骨髓間充質干細胞神經保護功能[J].細胞生物學雜志，2007;29(4):595-599.