HIV/AIDS患者B7-H1的表達與合并機會性感染關系的研究①

謝榮華 歐陽珊珊 (湖南環境生物職業技術學院，衡陽421005)

HIV/AIDS患者存在免疫缺陷，死亡的主要原因是因為免疫缺陷而導致機會性感染，早期預防及發現機會性感染可提高和延長HIV/AIDS患者生命。B7-H1(B7-homolog)是新發現的重要的共刺激分子之一，也稱為程序死亡分子1配體-1(Programmed death-1 ligand-l，PD-L1)，B7-H1 主要表達在活化的T淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞(DC)、B淋巴細胞和部分腫瘤組織。B7-H1主要和程序死亡分子-1(Progrdeath-1，PD-1)結合傳遞負調節信號，導致免疫功能降低[1]，Barber等[2]在慢性病毒感染的鼠體內注射B7-H1單克隆抗體，即使在CD4+T淋巴細胞耗竭的情況下，亦能改善特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)功能，抑制體內病毒載量，改善臨床癥狀。因此，B7-H1在艾滋病免疫發病機制中起著重要作用。我們觀察HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達變化，并探討其與合并機會性感染的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 為某院2009年1月至2012年5月HIV/AIDS住院患者42例，年齡25～67歲，平均(45±7)歲，其中男25例，女17例，根據HIV/AIDS患者是否合并機會性感染，將HIV/AIDS患者分為HIV/AIDS未合并機會性感染組和合并機會性感染組，所有病例均HIV感染確證試驗陽性，符合中華人民共和國HIV/AIDS國家診斷標準[3]，排除自身免疫性疾病等，另選擇年齡和性別與病人相匹配的健康對照42名。

1.2 研究方法

1.2.1 HIV/AIDS機會性感染診斷 機會性感染的診斷標準:①確診為HIV/AIDS患者;②具有相關機會性感染的典型臨床癥狀、體征和輔助檢查表現;③臨床標本中或組織病理學檢查證實病原體存在。符合①②者為臨床診斷，符合①②③或①③者為病原學診斷，具體參照2003年美國《成人及青少年HIV感染者機會性感染防治指南》[4]。

1.2.2 主要試劑和儀器 美國BD公司FACSCalibur型流式細胞儀，鼠抗人 Lin1-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP均購自美國 BD公司，鼠抗人 B7-H1-PE購自美國eBioscience公司;CD4+T淋巴細胞計數試劑盒為美國BD公司TriTEST三色試劑。bDNA法檢測HIV-1 RNA病毒載量，儀器為德國Bayer公司System340 bDNA Analyer，試劑盒為德國Bayer公司3.0檢測試劑盒。

1.2.3 Ficoll-Hypaque密度離心法分離外周血單個核細胞(PBMC) 取新鮮采集的健康人、HIV/AIDS患者靜脈EDTA抗凝全血，1 500 r/min離心10分鐘，取血漿-80℃冰箱凍存。去除血漿后的血用PBS稀釋，充分混勻后，緩慢加至人淋巴細胞分離液液面上，2 500 r/min離心20分鐘;取中間白膜層加至另一離心管中，PBS洗滌2次，得到PBMC。

1.2.4 B7-H1表達水平的流式細胞儀分析 密度梯度法分離HIV/AIDS患者及健康對照外周血單個核細胞并計數(PBMC)，應用以下熒光標記的單抗進行染色，Lin1-FITC、CD11c-APC、HLA-DR-PerCP、B7-H1-PE并設同型對照，4℃避光染色30分鐘，加入2 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入含1%多聚甲醛的PBS重懸，FACSAria流式細胞儀Diva軟件進行分析。用 FSC、SSC、CD11C、HLA-DR、Lin1定義mDC(mDC表面特征性標志為CD11chighHLADR+Lin 1-)，分析這一群細胞B7-H1的表達水平。

1.3 統計學分析 應用SPSS11.5軟件包進行統計學分析，數據以±s表示，相關性采用pearson相關進行分析，所有檢驗均取P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HIV/AIDS患者 mDC上 B7-H1表達水平、CD4+T細胞計數及病毒載量(見表1) HIV/AIDS患者合并機會性感染B7-H1表達水平為23.57%±7.24%，未合并機會性感染者，為9.33%±6.02%，健康對照為0.36%±0.12%。HIV/AIDS患者的mDC上B7-H1表達水平均高于健康對照組，顯示為合并機會性感染者＞未合并機會性感染者＞健康對照(均P＜0.05)。HIV/AIDS患者合并機會性感染CD4+T細胞計數明顯低于未合并機會性感染組(P＜0.05)，未合并機會性感染組明顯低于健康對照組(P＜0.05);病毒載量，HIV/AIDS患者合并機會性感染明顯高于未合并機會性感染(P＜0.05)，未合并機會性感染明顯高于健康對照組(P＜0.05)。

2.2 HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平與CD4+T細胞數量及血漿病毒載量的相關性分析(見圖1、2) HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平，與CD4+T細胞數量呈顯著負相關(r=-0.665，P＜0.05)，而與血漿病毒的載量呈明顯正相關(r=0.604，P ＜0.05)。

2.3 HIV/AIDS患者機會性感染發病率與mDC上B7-H1表達水平的關系(見表2) 對42例HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平進行檢測，發現B7-H1表達水平＞30%機會性感染率為100.00%，B7-H1表達水平＜10%機會性感染率為28.57%，兩組比較有顯著性差異(P＜0.05)，42例 HIV/AIDS患者發生機會性感染31例，總體感染率73.81%，隨著B7-H1表達水平升高機會性感染率增高。

表1 42例成人HIV/AIDS患者與健康對照者mDC上B7-H1表達水平、CD4+T細胞數量及病毒載量檢測Tab．1 Detection of the level of B7-H1 on mDC ，CD4+T cell absolute counts and plasma viral loads from 42 HIV/AIDS patients and 42 health controls

圖1 HIV/AIDS患者B7-H1表達水平與CD4+T細胞數量的相關性Fig．1 Association between level of B7-H1 expression and CD4+T cell counts

圖2 HIV/AIDS患者B7-H1表達水平與病毒載量的相關性Fig．2 Association between level of B7-H1 expression and plasma viral loads

3 討論

HIV/AIDS是一種由HIV侵犯CD4+T細胞受損為主要特征的繼發性細胞免疫缺陷性疾病。HIV在增殖過程中通過直接毒性作用、細胞融合、自身免疫等破壞方式殺傷CD，導致免疫功能低下，進而引起各種病原體如弓形蟲、卡氏肺孢子蟲、結核、霉菌等感染和腫瘤，導致出現各種感染的綜合征和臨床體征。B7-H1及其受體PD-1屬于負性共刺激分子，兩者相互作用能夠降低T淋巴細胞的免疫功能，同時影響多種Th1和Th2型細胞因子的分泌[5]，如下調IL-2和IFN-γ分泌。最近有多篇關于病毒感染可以誘導B7-H1和PD-1的表達上調的報道。陳良恩研究慢性乙型肝炎患者免疫細胞B7-H1表達上調[6]，從而抑制了 T淋巴細胞的功能。Trabattoni等[7]發現HIV患者外周血淋巴細胞B7-H1表達水平與HIV患者的病情進展有著密切的聯系，B7-H1表達水平越高，患者的病情越嚴重。本研究對42例HIV/AIDS住院患者進行外周血髓樣樹突細胞(mDC)上B7-H1表達水平檢測，同時檢測外周血CD4+T細胞數量與病毒載量，結果顯示，HIV/AIDS患者的mDC上B7-H1表達水平均明顯高于健康對照組，而合并機會性感染者高于未合并機會性感染者，未合并機會性感染者高于健康對照;HIV/AIDS患者合并機會性感染CD4+T細胞計數明顯低于未合并機會性感染組，未合并機會性感染組明顯低于健康對照組，與國外其他研究者的結論一致[8];病毒載量合并機會性感染者明顯高于未合并機會性感染，未合并機會性感染者明顯高于健康對照組。HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平，與CD4+T細胞數量呈顯著負相關，而與血漿病毒的載量呈明顯正相關。42例HIV/AIDS患者mDC上B7-H1表達水平＞30%機會性感染率為100.00%，B7-H1表達水平＜10%機會性感染率為28.57%，42例HIV/AIDS患者發生機會性感染31例，總體感染率73.81%，隨著B7-H1表達水平升高機會性感染率增高。提示B7-H1表達與疾病進展關系密切，是HIV感染疾病進展的標志之一，深入研究B7-H1-PD-1信號途徑對HIV感染免疫功能的影響及調節免疫功能的機制，將對理解共刺激分子家族的相互關系及其復雜性具有重要意義，同時也為闡明HIV感染效應T淋巴細胞免疫耐受的可能機制及臨床免疫治療提供新的思路。綜上所述，B7-H1、CD4+T細胞計數與機會性感染關系密切，定期監測B7-H1、CD4+T細胞，加強機會性感染的預防，盡可能延長患者的生命和提高患者的生活質量。

表2 HIV/AIDS患者機會性感染發病率與mDC上B7-H1表達水平Tab．2 The relationship between the expression of the B7-H1 on mDC and incidence of opportunistic infection in HIV/AIDS patients

1 Chen L.Co-inhibitory molecules of the B7-CD28 family in the control of T-cell immunity[J].Nat Rev Immunol，2004;4(5):336-347.

2 Barber D L，Wherry E J，Masopust D et al．Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection [J].Nature，2006;439(7077):682-687.

3 Chinese Medical Association.Chinese Center for Disease Control and Prevention guidelines for diagnosisand treatment of HIV/AIDS in China(2005)[J].Chin Med J，2006;119(19):1589-1608.

4 Benson C A，Kaplan J E，Masur H et al．Treating opportunistic infections among HIV-infectin adults and adolescents:recommendations form CDC，the National Instiutes of Health，and the HIV Medicine Association/Infectious Diseases Society of America[J].MMWR Hocomm Rep，2004;53(RR15):1-112.

5 Salama A D，Chitnis T，Imitola J et al．Critical role of the programmed death-1(PD-1)pathway in regulation of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Exp Med，2003;198(1):71-78.

6 陳良恩，陳威巍，付寶云et al.B7-H1/PD-1共刺激途徑對慢性乙型肝炎患者HBV特異性淋巴細胞功能的影響[J].中華微生物和免疫學雜志，2007;27(9):826-830.

7 Trabattoni D，Saresella M，Biasin M et al．B7-H1 is up-regulated in HIV infection and is a novel surrogate marker of disease progression[J].Blood，2003;101(7):2514-2520.

8 Tansuphaasawedikui S，Amornkui P N，Tanchanpong C et al．Clinical presentation of hospitalized adultpatients with HIV infection and AIDS in Bangkok，Thailand[J].Acquir Immune Defic Syndr，1999;21(4):326-332.