EGR-1基因轉染對高糖環境中小鼠腎小球系膜細胞TGF-β及PDGF-B表達的影響

劉 潔 候明輝 劉 莉 張 耀 孟 杰 郭雅卿 李鴻燕

(河北大學附屬醫院內分泌科，保定071000)

早期生長反應因子(The early growth responsive gene-1，EGR-1)為即刻早期反應基因(Immediate early genes，IEGs)家族中最重要的一員，在神經、循環、泌尿、呼吸等多個系統控制細胞增殖、分化和凋亡[1]。研究表明，在大鼠抗Thy-1.1抗體腎炎模型中，EGR-1在系膜細胞增殖和系膜基質形成的高峰期表達上調，表明其通過調節系膜細胞增殖和細胞外基質聚積參與了腎小球硬化過程[2]。但是，其具體的作用機制尚不明了。

體內外實驗證明，糖尿病腎病時，腎小球系膜細胞轉化生長因子-β(TGF-β)及血小板源性生長因子-B(PDGF-B)表達增加，可促進系膜細胞增殖，在糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)的發生發展中起重要作用。目前關于EGR-1與TGF-β、PDGF-B的關系，及其在DN發病機制中的作用國內外尚無研究報道。本實驗通過體外轉染EGR-1基因，觀察高糖環境下EGR-1基因對系膜細胞TGF-β、PDGF-B表達及Ⅳ型膠原分泌的影響，探討EGR-1與系膜細胞增殖和細胞外基質代謝之間的關系，進一步揭示EGR-1在DN發生、發展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠腎臟系膜細胞株SV40MES13由美國模式菌種收集中心提供;pcDNA3.1-Egr-1、pc DNA3.1由美國Invitrogen生命技術公司提供;LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司);DMEM/F12培養基(美國Gibco BRL公司);胎牛血清(杭州四季青公司);潮霉素 B(Roche公司);兔抗小鼠EGR-1單克隆抗體(Santa Cruz公司);兔抗小鼠TGF-β、PDGF-B單克隆抗體(Santa Cruz公司);Ⅳ型膠原ELISA試劑盒、MTT(美國Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 從液氮中取出凍存的小鼠系膜細胞迅速復蘇后轉入25 cm2塑料培養瓶，CO2培養箱(5%CO2，37℃)靜置培養24～48小時，待細胞充分貼壁后每隔2～3天換液1次，約3～5天細胞長滿瓶底進行細胞傳代。系膜細胞生長至75%～85%融合，分別用無血清DMEM/F12傳統培養基洗一次，換無血清培養基孵育24小時，使細胞同步化，分成4個實驗組，即正常對照組(A組，非轉染的系膜細胞，5.5 mmol/L葡萄糖環境)、高糖組(B組，非轉染的系膜細胞，30 mmol/L葡萄糖環境)、高糖+空質粒組(C組，轉染空質粒的系膜細胞，30 mmol/L葡萄糖環境)和高糖+EGR-1質粒轉染組(D組，轉染EGR-1質粒的系膜細胞，30 mmol/L葡萄糖環境)(按Lipofectamine 2000說明書方法進行轉染)，于12、24、48小時末收集各組細胞上清液，-80℃保存，用于Ⅳ型膠原的測定。用預冷的PBS洗滌細胞兩次，將各瓶液體倒干，然后加入預冷的裂解液300 μl，冰浴靜置1小時，然后4℃、14 000 r/min離心25分鐘，吸取上清。采用考馬司亮藍法測定上清液蛋白濃度，分裝，-80℃保存。

1.2.2 MTT法檢測小鼠系膜細胞的增殖 取對數生長期的系膜細胞以密度1×105ml-1接種于96孔板內，100 μl/孔，培養 24小時后，用無血清的DMEM/F12培養液，繼續培養24小時，使細胞同步于G0期，然后棄上清，按上述分組給予高糖刺激，分別作用12、24、48小時后測系膜細胞的增殖。于各組實驗結束前4小時加入20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，37℃繼續孵育4小時，棄去上清，每孔加入150 μl DMSO終止反應，振蕩溶解，于酶標儀波長490 nm處讀取吸光度(A)值。試驗重復3次，每組設6個復孔。

1.2.3 免疫細胞化學檢測各組系膜細胞中EGR-1、TGF-β、PDGF-B蛋白表達 采用6孔板細胞爬片，分別于12、24、48小時終止培養，細胞用0.01 mol/L PBS沖洗數次，4%多聚甲醛固定30分鐘;蒸餾水和PBS各沖洗5分鐘;3%H2O2甲醇室溫孵育10分鐘滅活內源性過氧化物酶;PBS沖洗2次，每次5分鐘;0.1%Trix X-100打孔37℃，20分鐘，PBS沖洗2次，每次5分鐘;正常山羊血清37℃封閉45分鐘;滴加1∶150稀釋的一抗，4℃過夜(PBS代替一抗做陰性對照);PBS沖洗，5分鐘×3次;滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育25分鐘;PBS沖洗，5分鐘×3次;滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液，37℃孵育20分鐘;PBS沖洗，5分鐘×3次;DAB顯色，鏡下觀察顯色情況;蒸餾水沖洗，終止顯色;梯度酒精脫水，透明、封片。每個指標檢測6孔細胞。

1.2.4 Western印跡法檢測各組系膜細胞中EGR-1、TGF-β、PDGF-B蛋白表達 每個樣品取50 μg總蛋白，加6×SDS加樣緩沖液，在沸水中變性4分鐘，經10%SDS-PAGE凝膠電泳后電轉移至PVDF膜;5%脫脂奶粉37℃封閉PVDF膜1.5小時，一抗(EGR-1 一抗工作液濃度為 1∶200，TGF-β、PDGF-B一抗工作液濃度為1∶300，GAPDH一抗工作液濃度為1∶500)，4℃過夜。TTBS洗膜后加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或小鼠二抗(1∶18 000稀釋)，37℃孵育2小時;TTBS洗膜，滴加ECL試劑，將PVDF膜放入X光片暗盒，在暗室中壓片，顯影，定影。用美國UVP公司LabWorks 4.5軟件對Western條帶進行定量分析，讀取積分光密度值(IOD)。

1.2.5 酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorben assay，ELISA)檢測細胞上清液中的Ⅳ型膠原含量 待細胞培養終止后收集培養液，1 000 r/min離心5分鐘以除去培養液中的細胞成分，取上清液以備檢測。本實驗采取雙抗體夾心ABC-ELISA法。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 EGR-1促進小鼠系膜細胞的增殖 從12小時開始，B組較A組小鼠系膜細胞吸光光度值開始升高，48小時達到高峰，差異有統計學意義(P＜0.01)，C組和B組相比差異無統計學意義(P＞0.05)，但D組變化趨勢更明顯，與C組和B組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.2 各組系膜細胞 EGR-1、TGF-β、PDGF-B蛋白表達 免疫細胞化學和Western blot結果顯示:從12小時開始，B組較A組小鼠系膜細胞EGR-1、TGF-β、PDGF-B蛋白水平開始升高，隨時間延長增強更明顯，且此趨勢持續到48小時，有統計學意義(P＜0.05)，C組和B組相比差異無統計學意義(P＞0.05)，但D組變化趨勢更明顯，與C、B組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1～6。

2.3 EGR-1誘導腎小球系膜細胞Ⅳ型膠原的分泌從12小時開始，B組小鼠系膜細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度較A組開始升高，48小時達到高峰，差異有統計學意義(P＜0.01)，C組與B組相比差異無統計學意義(P＞0.05)，但D組系膜細胞上清液中

Ⅳ型膠原濃度升高最明顯，與其他組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表1 EGR-1對高糖環境下系膜細胞增殖的影響(±s，n=6)Tab．1 Effects of EGR-1 on proliferation of glomerular mesangial cell(±s，n=6)

表1 EGR-1對高糖環境下系膜細胞增殖的影響(±s，n=6)Tab．1 Effects of EGR-1 on proliferation of glomerular mesangial cell(±s，n=6)

Note:A.NG;B.HG;C.HG+pcDNA3.1;D.HG+pcDNA3.1-Egr-1.1)P＜0.01 vs group A;2)P＜0.05 vs group B and C.

Groups 12 h 24 h 48 h A 0.231±0.004 0.342±0.005 0.470±0.004 B 0.436±0.0061) 0.639±0.0051) 0.737±0.0061)C 0.428±0.0041) 0.637±0.0041) 0.753±0.0051)D 0.648±0.0052) 0.859±0.0092) 0.947±0.0102)

表2 各組細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度(μg/L，±s，n=6)Tab．2 Concentration of type Ⅳ collagen in the supernatant of mesangial cells of every group(μg/L，±s，n=6)

表2 各組細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度(μg/L，±s，n=6)Tab．2 Concentration of type Ⅳ collagen in the supernatant of mesangial cells of every group(μg/L，±s，n=6)

Note:A.NG;B.HG;C.HG+pcDNA3.1;D.HG+pcDNA3.1-Egr-1.1)P＜0.01 vs group A;2)P＜0.05 vs group B and C.

Groups 12 h 24 h 48 h A 6.33±0.125 7.04±0.78 8.15±1.12 B 11.05±1.031) 13.06±1.001) 16.08±0.881)C 10.99±1.161) 12.73±0.431) 15.96±0.491)D 13.48±0.962) 15.69±0.502) 19.16±0.712)

圖1 高糖培養48小時后各組系膜細胞EGR-1的表達(免疫細胞化學，×400)Fig．1 Immunocytochemical staining for EGR-1 in glomerular mesangial cells after 48 hours(×400)

圖2 高糖培養48小時后各組系膜細胞TGF-β的表達(免疫細胞化學，×400)Fig．2 Immunocytochemical staining for TGF-β in glomerular mesangial cells after 48 hours(×400)

圖3 高糖培養48小時后各組系膜細胞PDGF-B的表達(免疫細胞化學，×400)Fig．3 Immunocytochemical staining for PDGF-B in glomerular mesangial cells after 48 hours(×400)

圖4 不同時間點各組系膜細胞EGR-1的蛋白表達(Western印跡)Fig．4 Western blot for EGR-1 protein in glomerular mesangial cells in every group

3 討論

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一，已經成為導致終末期腎衰竭的主要原因。腎小球系膜細胞具有收縮、吞噬和產生細胞外基質等多種功能，在維持腎臟正常生理功能及腎臟病變的發生發展中起重要作用[3]。系膜細胞可以產生細胞外基質、蛋白酶(絲氨酸蛋白酶和基質金屬蛋白酶等)和蛋白酶抑制劑(絲氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶組織抑制劑等)。正常生理條件下，它們之間處于一種動態平衡。但在糖尿病狀態下，高糖、血管緊張素Ⅱ、炎癥、氧化應激產物等有害刺激作用下，蛋白酶的功能減退或蛋白酶抑制劑活性增強時，就會引起細胞外基質的沉積和腎小球硬化。

圖5 不同時間點各組系膜細胞TGF-β的蛋白表達(Western印跡)Fig．5 Western blot for TGF-β protein in glomerular mesangial cells in every group

圖6 不同時間點各組系膜細胞PDGF-B的蛋白表達(Western印跡)Fig．6 Western blot for PDGF-B protein in glomerular mesangial cells in every group

早期生長反應元件(Early growth response-1，EGR-1)也稱為NGFI-A、zif268、krox-24 及TIS8，為鋅指轉錄因子，也是即刻反應基因(Immediate-early gene)的產物[4，5]，位于人的第5 對染色體 q23-31，長2.1 kb，編碼3.3 kb成熟的mRNA，其下游為EGR-1基因的外顯子區域，編碼由543個氨基酸組成的EGR-1蛋白產物，分子量為80～82 kD。人與小鼠的EGR-1基因在核酸與蛋白水平方面的同源性分別為87%和94%。EGR-1中心區域尚有三個完全一致的半胱氨酸/組氨酸型鋅指結構，與富含GC的DNA序列特異結合，發揮轉錄因子的作用[6]。

EGR-1僅在快速反應的器官表達，而在慢反應的器官和組織表達卻很弱，甚至不表達。在成熟小鼠的腦、甲狀腺、心臟、肺、腎等部位呈高表達，而肝、脾、睪丸等為低表達;在人體組織中只有少數器官，包括腦、心、肺能達到相對高的水平，在人體正常的乳腺組織中亦可檢測到EGR-1的高表達[7，8]。在多種刺激物如電離射線、紫外線照射、張力刺激、低氧、缺血/再灌注損傷、化療藥物、多肽生長因子、切應力和尿素等的作用下可見到EGR-1表達增加，使細胞由G0期進入G1期，導致細胞增殖[9]。國外文獻報道，在泌尿系統已有研究發現在單側輸尿管梗阻致腎間質纖維化模型，應用電穿孔技術使DNA酶導入成纖維細胞特異地阻斷EGR-1表達，相應地減少了TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原mRNA的表達，減少了肌成纖維細胞形成，抑制了腎間質纖維化[1，2]。此外EGR-1在系膜細胞增殖和系膜基質積聚性病變中表達明顯，在系膜細胞肥大、增生和系膜基質增多等方面起著重要作用，在體外培養的大鼠系膜細胞中EGR-1表達升高可促使系膜細胞增殖，應用反義寡核苷酸將EGR-1阻斷后，系膜細胞增殖降低。本實驗結果表明，與正常糖組相比較，高糖組腎小球系膜細胞EGR-1基因表達升高，系膜細胞增殖及Ⅳ型膠原分泌明顯;與高糖組相比較，EGR-1基因轉染組系膜細胞增殖及Ⅳ型膠原分泌更加顯著，說明高糖可促進EGR-1基因高表達，EGR-1基因可誘導系膜細胞的增殖及Ⅳ型膠原分泌。Soon等[10]研究證明EGR-1可通過上調系膜細胞中基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達，抑制細胞外基質降解，促進系膜外基質沉積，加重腎小球硬化，與上述研究結果一致。

研究表明，EGR-1也是關鍵調節因子，調控多個基因的表達[11]。寡核苷酸為基礎的基因芯片分析揭示了依賴于EGR-1的基因數目超過300個[12]。在許多基因的啟動子中都有功能性EGR-1的結合位點。通過與靶基因結合，EGR-1可調節一系列與細胞生長分化和細胞凋亡、炎性細胞趨化、免疫刺激等相關的多種基因表達。其可調控細胞間黏附分子-1(Intercelluaradhesionmolecule-1，ICAM-1)、血小板衍生生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)A/B鏈、轉化生長因子-β(Transforming growth factor-β，TGF-β)、巨噬細胞集落刺激因子(Macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)、組織因子(Tissue factor，TF)、尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑(Urokinase-type plasminogen activator，u-PA)，bFGF、IL-2、TNF-α、CD44，以及 EGR-1 自身啟動子的表達，從而發揮信號傳導通路中介作用[13，14]。本實驗結果表明，高糖刺激下腎小球系膜細胞 EGR-1、TGF-β、PDGF-B 表達升高，轉染 EGR-1基因后，系膜細胞TGF-β和PDGF-B表達升高更加顯著，提示EGR-1可促進TGF-β、PDGF-B的表達，進一步促進系膜細胞的增殖及細胞外基質分泌，加速腎小球硬化，進而在DN腎損害和纖維化中起重要作用，但其具體作用機制尚需進一步研究證實。

總之，目前對EGR-1基因具體的生物學功能尚不清楚，探討EGR-1基因高表達對腎小球系膜細胞TGF-β和PDGF-B的表達及系膜細胞增殖，細胞外基質沉積的影響，對進一步明確EGR-1基因在糖尿病腎病發生、發展中的作用機制具有重要意義，將為臨床提供糖尿病腎病早期干預的新靶點，為人類防治糖尿病腎病提供理論依據。

1 Gerhard H，Claudia G，Vikas P et al.Transcription factor Egr-1 regulates glomerular mesangial cell proliferation[J].Biol Chem，1996;271(45):28306-28310.

2 Harald D，Rupprecht，Yoshitaka A et al.Nitric oxide inhibits growth of glomerular mesangial cells:Role of the transcription factor EGR-1[J].Kidney International，1999;57(2000):70-82.

3 Kanwar Y S，Wada J，Sun L et al.Diabetic nephropathy:mechanisms of renal disease progression[J].Exp Biol Med，2008;233(1):4-11.

4 Blaschke F，Bruemmer D，Law R E.Egr-1 is a major vascular pathogenic transcription factor in atherosclerosis and restenosis[J].Rev Endocr Metab Disord，2004;5(3):249-254.

5 Khachigian L M.Early growth response-1 in cardiovascular pathobiology[J].Circ Res，2006;98(2):186-191.

6 Yifan Lu，Tong Li，Hamid Y et al.Early growth response 1(Egr-1)regulates phosphorylation of microtubule-associated protein tau in mammalian brain[J].Biol Chem，2011;286(13):20569-20581.

7 莊楚香，吳名耀.Egr-1在小鼠和人體正常組織中的表達及其生理學功能[J].汕頭大學醫學院學報，2001;14(3):166-168.

8 吳名耀，莊楚香.Egr-1在小鼠和人組織中的表達及其與細胞增殖的關系[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2002;11(1):72-74.

9 Danuta S，Bernd G，Christina S et al.Mycophenolic acid inhibits the autocrine PDGF-B synthesis and PDGF-BB-induced mRNA expression of Egr-1 in rat mesangial cells[J].Nephrol Dial Transplant，2009;24(1):52-61.

10 Soon Y，Ji H，Andrew B et al.Transcription factor Egr-1 is essential for maximal matrix metalloproteinase-9 transcription by tumor necrosis factor[J].Mol Cancer Res，2010;8(4):507-519.

11 Khachigian L M.Early growth response-1 in cardiovascular pathobiology[J].Circ Res，2006;98(2):186-191.

12 Frédéric B，Simon D，Katherine B et al.EGR-1 activation by EGF inhibits MMP-9 expression and lymphoma growth[J].Blood，2010;116(5):759-766.

13 Yunlu Xu，Fatouma T，Wu Qu et al.Advanced glycation end product(AGE)-receptor for AGE(RAGE)signaling and up-regulation of egr-1 in hypoxic macrophages[J].Biol Chem，2010;285(30):23233-23240.

14 Ossie F，Dyson，Christopher M et al.Interferon tau regulates PGF2 release from the ovine endometrial epithelial cells via activation of novel JAK/EGFR/ERK/EGR-1 pathways[J]Biol Chem，2010;285(11):37491-37502.