甲砜霉素及氟苯尼考胺單克隆抗體的制備及特性鑒定

金銀珍，劉智宏，王鶴佳，黃耀凌，張聰敏

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

酰胺醇類抗生素除其代表藥物——氯霉素外，還有甲砜霉素和氟苯尼考(氟甲砜霉素)。但是由于氯霉素存在嚴重的副作用，國際上相繼禁止或嚴格限制使用氯霉素，目前出現(xiàn)了用甲砜霉素和氟苯尼考替代氯霉素使用的趨勢［1－2］。甲砜霉素和氟苯尼考屬廣譜抑菌藥物，具有較高的抗菌活性，主要用于治療畜、禽腸道、呼吸道等細菌性感染［3］，尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用。但是甲砜霉素仍有免疫抑制作用，其使用有引起耐藥性細菌存在的風險，除我國和日本外，歐盟和美國均將甲砜霉素禁用于食品動物。我國規(guī)定甲砜霉素在各種動物組織中的最高殘留限量(MRL)為50 μg/kg，氟苯尼考殘留標示物為氟苯尼考胺，其在不同動物肌肉組織中的 MRL 為 100 ～300 μg/kg［4］。

已報道的動物組織中甲砜霉素和氟苯尼考殘留檢測方法有氣相色譜法［5－6］、氣相色譜 － 質(zhì)譜法［7］、高效液相法和高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［8］及甲砜霉素和氟苯尼考胺酶聯(lián)免疫檢測方法［9－11］。本研究以本試驗室建立的甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺多殘留酶聯(lián)免疫檢測方法為基礎(chǔ)，應(yīng)用能穩(wěn)定分泌抗甲砜霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株，可為甲砜霉素及氟苯尼考胺檢測試劑盒提供長期穩(wěn)定的單克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和試劑 酶標讀數(shù)儀，SUNRISE，TECAN公司;臺式高速冷凍離心機，Biofuge stratos，Heraeus公司;漩渦振蕩器，MS2，IKA公司;電子天平，Sartorious公司;倒置顯微鏡，Olympus公司;甲砜霉素標準品，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備;氟苯尼考胺，TRC公司;聚乙二醇(PEG)4000、氟苯尼考、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、Giemsa染料、秋水仙素、HRP標記羊抗鼠IgG及羊抗鼠IgG亞類抗體，Sigma公司;DMEM干粉培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT及HT，Gibco公司;其他所有化學試劑均為分析純;檢測抗原為本實驗室自制。

1.1.2 溶液 洗液：0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液，0.05%Tween －20，pH 7.2。封閉液：5% 脫脂奶洗液。包被緩沖液：0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，pH 9.5。標準溶液：0、0.2、1、5、25、125 μg/L 甲砜霉素標準品溶液。底物溶液：0.01%TMB，以0.1 mol/L磷酸鹽－檸檬酸緩沖液(pH 5.0)配制。

1.1.3 動物及細胞系 Balb/c小鼠，北京實驗動物中心提供;Sp2/0骨髓瘤細胞由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 酰胺醇類藥物免疫抗原制備和免疫 免疫抗原的制備及鑒定按文獻［11］進行。以免疫抗原免疫6～8周齡雌性Balb/c小鼠20只，首次免疫用2 mg/mL免疫抗原(以載體蛋白計)1 mL，加等量弗氏完全佐劑乳化，免疫劑量為100 μg/只，于小鼠頸部、背部皮下多點注射。以后與首次免疫相同的劑量加弗氏不完全佐劑進行加強免疫3次，每次間隔2周。于末次免疫后7 d采血，用間接ELISA測定血清效價。選擇抗血清效價高及競爭抑制強的小鼠脾臟進行細胞融合，融合前3 d腹腔注射加強免疫。

1.2.2 間接競爭ELISA方法的建立 將檢測抗原用碳酸鹽緩沖液稀釋，包被酶聯(lián)板，每孔150 mL，4℃放置過夜。傾去孔內(nèi)液體，拍干，加入洗液250 mL，洗板3次。加入封閉液每孔250 mL，室溫放置2 h，洗液洗板3次。酶標板單數(shù)列加入0濃度標準溶液50 mL，雙數(shù)列加入100 ng/mL濃度甲砜霉素標準溶液50 mL，取1000倍稀釋的小鼠血清(或細胞上清液)50 mL分別加到兩濃度的酶標板中，室溫孵育1 h。洗液洗板3次，每孔加入羊抗鼠IgG溶液100 mL，室溫孵育30 min。洗液洗板3次。加入底物溶液100 mL，避光顯色10～30 min。加入終止液100 mL，在450 nm波長處測定吸光度值。

1.2.3 細胞融合、克隆及腹水制備［12］免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0以5～10∶1的比例混合，用50%PEG作融合劑將兩種細胞融合，將融合細胞懸于含20%胎牛血清的2%HAT選擇性培養(yǎng)基內(nèi)，加到96孔細胞培養(yǎng)板中，37℃下于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在融合后第7～12天，細胞生長達1/3～1/4視野時，取融合細胞的上清液進行篩選。以篩選到與0濃度標準溶液有反應(yīng)，與100 ng/mL濃度甲砜霉素有明顯抑制的細胞孔進行亞克隆。一般亞克隆后第7～10天再次進行單克隆孔的ELISA篩選，如此亞克隆3～5次，至陽性率達100%為止。然后進行擴大培養(yǎng)，并將細胞于液氮下保存。

選取20～22 g雌性Balb/c小鼠20只，腹腔注射0.5 mL液體石蠟7 d后，腹腔注射雜交瘤2×106細胞，7～14 d后待小鼠腹部顯著膨隆，抽取小鼠腹水，5000 r/min離心5 min，吸出上清液備用。

1.2.4 單克隆抗體類型的鑒定 用1%瓊脂糖磷酸鹽緩沖液制備平板，取小鼠腹水10 mL加到中心孔，加羊抗鼠IgG各亞類抗體10 mL到周邊孔中進行瓊脂擴散試驗，37℃濕盒孵育過夜。

1.2.5 雜交瘤細胞的染色體分析 按實驗室常規(guī)方法進行［12］。

1.2.6 抗體效價及靈敏度測定 用洗液系列稀釋雜交瘤細胞上清液及小鼠腹水，按1.2.2項方法操作，取0濃度標準溶液OD值為1.5～1.8的抗體稀釋倍數(shù)作為抗體效價。選擇系列稀釋的甲砜霉素藥物濃度，選擇最佳抗體濃度，按基本間接競爭ELISA進行測定。以甲砜霉素濃度的對數(shù)值為X軸，以各濃度的OD值除以0濃度的OD值(B/B0)為Y軸，繪制標準曲線，確定IC50濃度范圍。

1.2.7 交叉反應(yīng)率 選擇酰胺醇類藥物氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺，分別配成系列濃度，按1.2.2項方法測定，確定IC50濃度。用下式計算各藥物對該抗體的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率=甲砜霉素IC50/待測藥物IC50×100%。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細胞株的建立 免疫5次后，采集免疫小鼠血清，用間接競爭ELISA測定小鼠抗血清對藥物的抑制程度，選擇抑制最明顯的2－1號小鼠進行細胞融合，2塊96孔細胞培養(yǎng)板全部有雜交瘤細胞形成，融合率為100%。用間接競爭ELISA檢測細胞上清液，其中有抑制的為26孔，選其中OD值較高的2個孔進行亞克隆，通過3次克隆化后獲得IC50較低的雜交瘤細胞株1E及5C，通過傳代、凍存及復蘇，其雜交瘤細胞生長良好并能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。

2.2 單克隆抗體特性鑒定結(jié)果

2.2.1 雜交瘤核型鑒定結(jié)果 本試驗獲得的雜交瘤1E染色體數(shù)目為96～102條，平均98條。

2.2.2 抗體類型鑒定 本試驗所制的單克隆抗體雜交瘤1E及5C所分泌的抗體類型為IgG2b。

2.3 靈敏度及效價測定 雜交瘤1E第一代細胞上清抗體效價為1∶5×103;將細胞凍存及復蘇傳代，第二代細胞上清效價為1∶5×103，腹水抗體效價為1∶1×106。

標準曲線濃度為 0.2、1、5、25、125 μg/L，相應(yīng)的對數(shù)值分別為 －0.7、0、0.7、1.4 及 2.1。IC50變動范圍為15～25 μg/L。標準曲線如圖1所示。

圖1 標準曲線

2.4 雜交瘤1E分泌的抗體交叉反應(yīng)率 測定4種藥物的IC50，得出系列交叉反應(yīng)率，結(jié)果見表1。

表1 交叉反應(yīng)試驗結(jié)果

3 討論

目前甲砜霉素和氟苯尼考胺殘留檢測主要以儀器方法為主，樣品一般經(jīng)過有機溶劑提取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、除脂肪，再經(jīng)固相萃取柱凈化等步驟進行處理，樣品處理方法比較復雜，不適合大量樣品檢測的需要。近幾年來，免疫檢測技術(shù)在抗生素、農(nóng)藥、毒素等小分子化合物殘留分析中的應(yīng)用越來越廣泛，而抗體的制備則是建立免疫檢測技術(shù)的關(guān)鍵。甲砜霉素、氟苯尼考與氯霉素化學結(jié)構(gòu)的區(qū)別是在基本結(jié)構(gòu)中用甲磺基取代了毒性較強的硝基。為了獲得能抗甲砜霉素及氟苯尼考胺，但不與氯霉素有交叉的抗體，本試驗用碳二亞胺法將氟苯尼考胺與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫抗原［11］，將苯環(huán)上的甲磺基暴露在外作為主要的抗原決定簇，通過小鼠免疫、細胞融合、篩選、克隆和腹水制備，獲得了抗甲砜霉素、氟苯尼考胺的特異性的單克隆抗體。盡管單克隆抗體的研究技術(shù)比較成熟，但小分子藥物的單克隆與大分子物質(zhì)的抗體制備有明顯區(qū)別，主要因為抗原的免疫原性較弱，且篩選方法不僅要考慮到抗體效價，而且要考慮抑制率高低等因素。合理的篩選程序?qū)δ芊瘾@得高親和力的單抗細胞株非常重要，本實驗選用自制的檢測抗原，用0濃度及高濃度甲砜霉素標準液進行篩選，獲得了抗甲砜霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株。盡管該抗體靈敏度不如本實驗室同期制備的多克隆抗體，但該單克隆抗體效價高，特異性及靈敏度基本能滿足實際檢測要求，可以為今后檢測試劑盒的研發(fā)及生產(chǎn)提供長期穩(wěn)定的抗體。

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［3］ 中華人民共和國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○○五年版一部［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：14－16.

［4］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號.動物性食品中獸藥最高殘留限量［S］.

［5］ 農(nóng)業(yè)部958號公告－13－2007.《水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定——氣相色譜法》［S］.

［6］ Alien P，Pfenning Jose E，Roybal Heidi S Rupp，et al.Simultaneous Determination of Residues of Chloramphenicol，F(xiàn)lorfenicol，F(xiàn)lorfenicol Amine，and Thiamphenicol in Shrimp tissue by Chromatography with Electron Capture Detection［J］.Journal of AOAC International，2000，83(1)：26 －30.

［7］ 農(nóng)業(yè)部958號公告－14－2007.《水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定——氣相色譜－質(zhì)譜法》［S］.

［8］ GB/T 207056－2006.《可食動物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定——LC－MS－MS》［S］.

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［12］ Heddy Zola.單克隆抗體手冊［M］.周宗安.譯.南京：南京大學出版社，1991.