雞毒支原體感染病理模型復(fù)制

孟冬霞，賀東昌，武果桃，任 杰，吳 忻，趙 娟，孫建剛，張偉業(yè)，劉文俊

(山西省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032)

雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum，MG)感染常稱之為雞慢性呼吸道病(CRD)，是家禽致病性最強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)損失最大的支原體病［1］。發(fā)病雞主要表現(xiàn)為氣管炎和氣囊炎，以咳嗽、氣喘、流鼻液和呼吸道啰音為特征［2］。多與大腸桿菌、傳染性鼻炎、新城疫和傳染性支氣管炎等引起呼吸道癥狀的疫病混合感染，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害極大，是影響雞群增重和生長(zhǎng)發(fā)育的嚴(yán)重疫病之一［3］。為進(jìn)行純綠色抗CRD的超微粉中藥復(fù)方參麻散(簡(jiǎn)稱FSMS)和復(fù)方明草散(簡(jiǎn)稱FMCS)的藥效學(xué)研究，本試驗(yàn)用MG標(biāo)準(zhǔn)菌株S6株接種16日齡雛雞進(jìn)行攻毒，攻毒后第5天用雞新城疫疫苗誘發(fā)，成功建立了雞毒支原體感染病理模型，為超微粉中藥的藥效學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 雞毒支原體標(biāo)準(zhǔn)菌株S6株，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.2 主要試劑 支原體肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖、L－半胱氨酸鹽酸鹽、小牛血清及瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，Genview公司產(chǎn)品。醋酸鉈，Sigma公司產(chǎn)品。青霉素，石家莊制藥廠產(chǎn)品。氫氧化鈉、酚紅為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)雞，山西達(dá)益園農(nóng)牧發(fā)展有限公司提供。

1.4 疫苗 雞新城疫中等毒力活疫苗(I系)，哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：2009105。

1.5 培養(yǎng)基的配制 改良Frey氏培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［1］配制，用20%NaOH調(diào)整pH至7.6并過(guò)濾除菌，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MG攻毒菌液 將5代 MG培養(yǎng)物(1011CCU/mL)，分別稀釋為 104、105、106、107、108、109CCU/mL作為本試驗(yàn)用菌液。

1.7 動(dòng)物分組及處理方法 將16日齡雛雞隨機(jī)分為6個(gè)攻毒組，每組5只雞，分別接種不同濃度MG 菌液，每只雞滴鼻0.3 mL、點(diǎn)眼0.2 mL，氣囊接種0.5 mL;接種后第5天用雞新城疫I系苗誘發(fā)(5羽份/只，含有雞新城疫病毒105.0ELD50/羽份，噴霧)。同時(shí)設(shè)2組對(duì)照組，每組5只雞，一組接種滅菌生理鹽水，一組接種濃度為109CCU/mL的MG菌液。觀察試驗(yàn)雞臨床癥狀，攻毒后第10天剖檢試驗(yàn)雞，觀察氣囊病理變化及氣囊損傷并計(jì)分。

氣囊損傷計(jì)分參照 Yoder［4］計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)分為五級(jí)：0級(jí)—?dú)饽艺＃鍧嵧该鞫。?jì)0分;1級(jí)—?dú)饽疑杂性龊窈洼p度渾濁，局部有少數(shù)灰色或黃色滲出物斑點(diǎn)，計(jì)2分;2級(jí)—部分氣囊區(qū)域有可見(jiàn)的灰色和黃色滲出物，同時(shí)伴有氣囊中度增厚，計(jì)4分;3級(jí)—大片氣囊布滿黃色干酪樣滲出物，計(jì)6分;4級(jí)—整個(gè)氣囊布滿黃色干酪樣滲出物，氣囊失去彈性，計(jì)8分。雞平均氣囊病理?yè)p傷度計(jì)分 =所有雞氣囊損傷度總和/被檢雞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀 不同方法處理后，試驗(yàn)雞的臨床癥狀見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，單純接種MG 109CCU/mL菌液時(shí)，僅2只雞有輕微的咳嗽。雞新城疫I系誘發(fā)時(shí)：MG菌液濃度達(dá)105CCU/mL以下，雞飲食基本正常;達(dá)105CCU/mL以上時(shí)，雞飲食減少，表現(xiàn)出不同程度的臨床癥狀;達(dá)109CCU/mL時(shí)，5只雞均有漿液或黏液性鼻液、頻頻搖頭、噴嚏、喘氣和咳嗽等癥狀。

表1 試驗(yàn)雞的臨床癥狀

2.2 剖檢結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)剖檢試驗(yàn)雞，氣囊病理變化及病理?yè)p傷計(jì)分結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，單純接種MG 109CCU/mL菌液時(shí)，僅有2只雞氣囊有黃色滲出物，氣囊病理?yè)p傷計(jì)分為4分。雞新城疫疫苗誘發(fā)時(shí)，接種不同MG菌液濃度對(duì)氣囊均有損傷作用，損傷程度大小不一。MG接種量達(dá)104CCU/mL即可對(duì)氣囊產(chǎn)生病變作用，氣囊病理?yè)p傷計(jì)分為2分，氣囊損傷度最小;MG接種量達(dá)106CCU/mL以上時(shí)，氣囊病變嚴(yán)重;MG接種量達(dá)108CCU/mL以上時(shí)，氣囊內(nèi)出現(xiàn)大量黃色炎性滲出物;MG接種量達(dá)109CCU/mL時(shí)，所有雞大片氣囊都布滿黃色干酪樣滲出物，氣囊病理?yè)p傷計(jì)分為6分，氣囊損傷度最大。故確定MG攻毒劑量為109CCU/mL。

表2 試驗(yàn)雞氣囊病理變化及病理?yè)p傷計(jì)分

3 討論

3.1 MG人工感染致病性與雞日齡、飼養(yǎng)條件、感染途徑等多種因素有關(guān)，本試驗(yàn)選用的MG S6株有一定毒力，為逃避機(jī)體外部防御屏障直接經(jīng)氣囊攻毒;由試驗(yàn)可見(jiàn)，單純MG攻毒可引起輕度氣囊病變，很難復(fù)制典型的CRD臨床癥狀和病理變化，雞新城疫I系作應(yīng)激因子誘導(dǎo)可提高M(jìn)G的致病性。

3.2 邵國(guó)青等［5］人在透明塑料隔離器內(nèi)以NDV、IBV弱毒誘導(dǎo)和70/1000000(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氨環(huán)境刺激作誘導(dǎo)，對(duì)SPF雞進(jìn)行雞毒支原體攻毒，成功建立了雞毒支原體人工發(fā)病封閉模型，但由于受嚴(yán)格的條件限制，在野外或大群雞作MG攻毒試驗(yàn)時(shí)不適用。本試驗(yàn)在MG S6(109CCU/mL)攻毒后第5天用雞新城疫中等毒力活疫苗(I系)進(jìn)行噴霧誘發(fā)，5羽份/只，成功建立了雞慢性呼吸道病野外環(huán)境人工發(fā)病的動(dòng)物模型，試驗(yàn)雞臨床表現(xiàn)漿液或黏液性鼻液、頻頻搖頭、噴嚏、喘氣和咳嗽、呼吸道啰音等特征，氣囊一側(cè)或兩側(cè)布滿黃色干酪樣滲出物，為復(fù)方參麻散和復(fù)方明草散藥效學(xué)研究的順利進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。

3.3 本試驗(yàn)所用MG菌液濃度為104～109CCU/mL，至于1010CCU/mL及更高滴度MG培養(yǎng)物，在不接種新城疫的情況下能否激發(fā)復(fù)制成功此模型，尚不能確定。

［1］ Saif Y M.禽病學(xué)(第十一版)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005：818 －867.

［2］ 陳煥春，陳杖榴，陸承平，等.2010年執(zhí)業(yè)獸醫(yī)資格考試應(yīng)試指南［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2010：675－677.

［3］ 石 喬，李繼昌.中藥治療雞毒霉形體病的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2006，33(4)：45 －46.

［4］ Yoder H W.A laboratory mannual of the isolation and identification of avian pathogens［M］.3rd ed.New York：American Association of Avian Pathologist，1989：57 －62.

［5］ 邵國(guó)青，許偉成，薛家賓，等.雞毒支原體人工發(fā)病封閉模型的建立［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，14：228 －231.