不同碳源對反硝化細菌生長的影響

李 建，潘康成

(1.中國獸醫藥品監察所，北京 100081;2.四川農業大學，四川雅安 625014)

人工反硝化細菌能有效去除硝酸鹽［1］，充足的碳源對固定化細菌的反硝化作用是必要的［2］，碳源是影響脫氮的主要因素之一［3］。環境中碳源不能滿足需要時，就必須投入其他碳源，以保證反硝化脫氮作用繼續進行［4］。碳源一直是異養反硝化作用的研究重點［5］，甲醇、乙酸等有機物可作為反硝化過程所需的外加碳源［6－8］。為尋找高效、經濟的外加碳源，探索反硝化細菌的發酵工藝，本實驗對葡萄糖、酒石酸鉀鈉、蔗糖、乙酸、乙醇等碳源對反硝化細菌生長的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 菌種 反硝化細菌XF03株(兼性厭氧)由四川農業大學動物醫學院發酵工程實驗室提供。

1.2 儀器 PYX－DHS隔水式電熱恒溫培養箱、奧林巴斯光學顯微鏡、電子天平。

1.3 試劑 酒石酸鉀鈉、葡萄糖、蔗糖、乙醇、冰乙酸、KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、蒸餾水、液體石蠟、NaOH、NaCl。

1.4 培養基

1.4.1 基礎培養基 KNO32.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.41 g［9］，酒石酸鉀鈉 20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2，115 ℃ 滅菌備用，用于種子液培養;在液體培養基中加0.7%(W/V)瓊脂粉，制成瓊脂平板培養基，用于活菌計數。

1.4.2 不同碳源培養基的制備 制備5種不同碳源培養基。以基礎培養基中的碳、氮源濃度及C/N為參比，其他物質不變，計算出其他碳源添加量(表1)，配制完畢，滅菌保存備用。

表1 5種液體培養基中碳源添加量

1.5 接種培養 取XF03株斜面菌種接種基礎液體培養基，用滅菌的液體石蠟覆蓋其表層，置于燭缸中35℃恒溫培養4 d后，進行活菌計數。然后取1 mL種子液分別接種9 mL上述5種不同的液體培養基，用滅菌的液體石蠟覆蓋其表層，置于35℃培養箱中，培養2、4、6 d后進行活菌計數。

1.6 活菌計數 采用平板計數法，進行活菌計數。取1 mL培養液加入9 mL基礎液體培養基進行10倍系列稀釋，選擇適當稀釋度的菌液滴基礎培養基瓊脂平皿3個，0.1 mL/個，使菌液均勻散開，置于燭缸中35℃培養4 d后計數菌落，計算活菌數。

1.7 數據統計 對活菌計數結果進行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 5種不同碳源對反硝化細菌生長的影響 5種液體培養基培養的反硝化細菌活菌數如表2所示。

表2 5種液體培養基培養的反硝化細菌XF03株活菌數 CFU/mL

2.2 結果分析

2.2.1 培養時間對細菌增殖的影響 含葡萄糖的菌液中，活菌數在 0、2、4、6 d 的比值為 1 ∶1.6 ∶133.7∶215.5。含酒石酸鉀鈉的菌液中，活菌數在0、2、4、6 d 的比值為 1 ∶15.4 ∶33.1 ∶40。含蔗糖的菌液中，活菌數在0、2、4、6 d 的比值為1 ∶4.8 ∶8.1 ∶16.4。含乙酸的菌液中，活菌數在 0、2、4、6 d 的比值為 1 ∶1.9 ∶3.8 ∶13.1。含乙醇的菌液中，活菌數在0、2、4、6 d 的比值為 1 ∶4.1 ∶5.5 ∶8.7。0 ～6 d細菌生長速度順序為:葡萄糖＞酒石酸鉀鈉＞蔗糖＞乙醇(或乙酸)(此處以碳源代表含此碳源的菌液，下同)。在5種液體培養基中，細菌在0～4 d培養時間越長，活菌數越高，活菌減少最早可能發生于4 d后，因此在相同條件下進行菌種增殖，培養時間不宜少于4 d。

2.2.2 不同碳源對細菌生長的影響 接種后2 d，活菌數順序為:葡萄糖＞酒石酸鉀鈉＞蔗糖＞乙醇＞乙酸，其比值為4.1 ∶3.8 ∶1.2 ∶1 ∶0.5。對有關數據進行t檢驗表明，葡萄糖與乙醇、葡萄糖與乙酸、酒石酸鉀鈉與乙醇、酒石酸鉀鈉與乙酸活菌數差異顯著;其余的菌液活菌數彼此之間差異不顯著。如果增殖培養2 d，添加葡萄糖或酒石酸鉀鈉效果較好。

接種后4 d，活菌數順序為:葡萄糖＞酒石酸鉀鈉 ＞ 蔗糖 ＞ 乙醇 ＞ 乙酸，其比值為24.3 ∶6.0 ∶1.5 ∶1∶0.7。對有關數據進行t檢驗表明，葡萄糖與乙酸、葡萄糖與酒石酸鉀鈉、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與乙醇、酒石酸鉀鈉與乙醇、酒石酸鉀鈉與乙酸活菌數差異極顯著;酒石酸鉀鈉與蔗糖活菌數差異顯著;其余的菌液活菌數彼此差異不顯著。如果增殖培養4 d，添加葡萄糖效果最好，添加酒石酸鉀鈉效果稍差一些。

接種后6 d，活菌數順序為:葡萄糖＞酒石酸鉀鈉 ＞ 蔗糖 ＞ 乙酸 ＞ 乙醇，其比值為24.4 ∶4.6 ∶1.9 ∶1.5∶1。對有關數據進行t檢驗表明，葡萄糖與乙酸、葡萄糖與酒石酸鉀鈉、葡萄糖與蔗糖、葡萄糖與乙醇活菌數差異極顯著;酒石酸鉀鈉與乙醇活菌數差異顯著;其余的菌液細菌濃度彼此差異不顯著。如果增殖培養6 d，添加葡萄糖效果較好。

綜上所述，在 35 ℃、pH 7.2、C/N=19的條件下，葡萄糖作為碳源對反硝化細菌XF03株生長的促進作用明顯優于其余4種碳源。

3 討論和結論

本實驗研究表明相對于酒石酸鉀鈉、蔗糖、乙醇和乙酸，在C濃度相同的情況下，葡萄糖作為唯一碳源更有利于反硝化細菌XF03株的增殖，能獲得較多的活菌。

反硝化實質上是氮的還原［10］，可以碳源作為電子供體［11］。電子供體為單一碳源有機物時，的降解速率受NO－3－N濃度和碳源有機物濃度的雙重影響［12］。反硝化細菌利用不同碳源，通過不同的呼吸途徑，產生的能量不同，細胞的產率也不同［13］。有機物質轉化成細胞的百分率越大，對其需求量越小［14］。反硝化細菌的細胞產率與碳源性質間的關系非常密切［15］。

需氧反硝化細菌可在有氧的條件下進行反硝化，菌種擴大培養相對容易。厭氧反硝化細菌可在厭氧的條件下進行反硝化，反硝化的效率較高，一般為自養型，可在無外源有機物的情況下完成增殖。兼性厭氧菌對溶解O2的濃度沒有嚴格要求，適用范圍更廣，能在偏酸性環境中生長，適于治理大面積水體N污染。

利用葡萄糖、酒石酸鉀鈉、蔗糖、乙酸和乙醇分別作為唯一碳源對比研究其對反硝化細菌增殖的影響，以找到適用于反硝化細菌增殖的最佳碳源。反硝化細菌XF03株以葡萄糖作為碳源進行菌種擴大培養和生物脫氮，具有較高的性價比和在生產中運用的現實性。

本實驗通過活菌計數結果來反映不同碳源對反硝化細菌生長的影響，在細菌進入衰退期之前，菌液中的活菌數可有效地反映細菌的生長狀況，活菌數越多，表明碳源越易被分解利用，細菌生長越迅速，碳源對該菌株增殖的促進作用越好，而且在實際應用中活菌數也是評價細菌生長狀況及其應用價值的一個重要指標。反硝化細菌XF03株作為兼性厭氧菌，比較適合用于NO－3污染的富營養化水體的生物脫氮。

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