不同解離方法對(duì)萊克多巴胺豬尿陽性樣品的提取效果研究

陳其煌

(廈門市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)測(cè)試中心，福建廈門 361012)

β－受體激動(dòng)劑在動(dòng)物體內(nèi)能促進(jìn)脂肪分解，增加蛋白質(zhì)的合成，提高酮體的瘦肉率，但是不當(dāng)使用容易造成其在動(dòng)物體內(nèi)殘留。人類食用了有藥物殘留的組織后引發(fā)呼吸加劇、頭痛、胸悶、心悸、心率加快、惡心和肌肉震顫等中毒癥狀，甚至導(dǎo)致死亡。我國已經(jīng)明確將這類藥物列入飼養(yǎng)食品動(dòng)物禁用藥品目錄。大多數(shù)β－受體激動(dòng)劑經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)代謝后主要以原形從尿液排出，因此檢測(cè)動(dòng)物尿液中β－受體激動(dòng)劑的含量顯得更直接、方便，且可實(shí)現(xiàn)宰前檢測(cè)。

萊克多巴胺是一種常見的β－受體激動(dòng)劑，屬于苯酚型β－受體激動(dòng)劑，在組織和排泄物中主要以葡萄糖醛酸軛合物形式存在，其殘留的檢測(cè)通常需要水解酶解步驟。目前，在測(cè)定動(dòng)物尿液樣品中萊克多巴胺含量時(shí)，多采用高氯酸溶液酸解和β－葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解，酶解方法主要有60℃水浴酶解2 h和37℃水浴酶解16 h［1－3］。各方法的提取效率大多以添標(biāo)測(cè)回收率作為考察驗(yàn)證依據(jù)，但對(duì)實(shí)際萊克多巴胺陽性的豬尿樣品的提取效果很少做過對(duì)比研究。本研究采取不同水解、酶解方法對(duì)萊克多巴胺陽性的豬尿樣品進(jìn)行提取試驗(yàn)對(duì)比，測(cè)定實(shí)際陽性樣品中萊克多巴胺含量，比較不同提取處理方法的差異性。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑 SHIMADZU 20A(CBM －20ACTO－20ALC－20ADSIL－20AC，日本島津公司);API 5000三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB公司);KQ－250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ZZDCH16水浴氮吹儀(廣州智真生物科技有限公司);DHG－9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Milli－Q去離子水發(fā)生器(Millipore公司);CF16RXⅡ高速冷凍離心機(jī)(日本 Hitachi公司);DELTA 320 pH計(jì)(梅特勒－托利多(上海)有限公司);PL602－S電子天平(梅特勒－托利多(上海)有限公司);VORTEX GENIUS 3旋渦混合器(德國IKA公司);Vacuum Manifold Processing Station固相萃取儀(美國Agilent公司);500 mg，3 mL，LC －SCX Sep Pak小柱(美國Supelco公司)。

萊克多巴胺(Ractopamine)標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)(Dr.Ehrenstorfer Gmbh);D6－萊克多巴胺內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(Ractopamine－d6)(純度98%，同位素純度99%)(Toronto Research Chemicals Inc.Canada);β－葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(94400 unit/mL β－Glucuronidase;1079 unit/mL Sulfatse)(Sigma公司);所用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇為色譜純?cè)噭?美國Tedia公司);高氯酸為優(yōu)級(jí)純(上海金鹿化工有限公司);鹽酸為優(yōu)級(jí)純(上海振興化工二廠有限公司);氫氧化鈉為優(yōu)級(jí)純(上海山海工學(xué)團(tuán)實(shí)驗(yàn)二廠進(jìn)口分裝);甲酸為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);氯化鈉為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙酸銨為分析純(汕頭市西隴化工廠有限公司);氨水為分析純(福建省三明市三圓化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)室用水為Milli－Q高純水。豬尿萊克多巴胺陽性樣品、陰性樣品來自屠宰廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 試樣處理和酶解 本實(shí)驗(yàn)設(shè)A、B、C三個(gè)處理，每個(gè)處理都采用3份豬尿陽性樣品(1號(hào)、2號(hào)、3號(hào))同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)處理每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理A:取5.0 mL尿液置于50 mL離心管，再加入0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)高氯酸溶液10 mL，漩渦混勻，加熱超聲30 min，冷卻后作為樣液備用;處理 B:取5.0 mL尿液置于50 mL離心管，加入1 mL 0.2 mol/L的乙酸銨緩沖液(pH 5.2)，再加入50 μL 3000 U/mL β － 葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，漩渦混勻，蓋上蓋子在60℃烘箱水浴酶解2 h，冷卻后作為樣液備用;處理C:取5.0 mL尿液置于50 mL離心管，加入1 mL 0.2 mol/L的乙酸銨緩沖液(pH 5.2)，再加入 50 μL 3000 U/mL β－葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，漩渦混勻，蓋上蓋子在37℃烘箱水浴酶解16 h，冷卻后作為樣液備用。三個(gè)處理均同步做空白添加試樣，添加濃度為2.0、20.0 ng/mL兩種水平，三個(gè)重復(fù)。

1.2.2 提取 酸解、酶解后，添加 60.0 μL 0.5 μg/mL D6－萊克多巴胺內(nèi)標(biāo)于各試樣中，漩渦混勻，用5.0 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào) pH 至9.8 ±0.2，加入10 mL乙酸乙酯 －異丙醇(6∶4，V∶V)，再加入4 g固體氯化鈉飽和水相，旋渦振蕩10 min，8000 r/min離心10 min，取上清液于50 mL離心管，再用10 mL乙酸乙酯 －異丙醇(6∶4，V∶V)重復(fù)提取一次，合并上清液，50℃下水浴氮吹儀吹干，用5 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖液溶解，備用。

1.2.3 凈化 LC－SCX柱子依次用5 mL甲醇、5 mL水和5 mL 30 mmol/L HCl活化平衡，取備用液全部過柱，再依次用5 mL水、5 mL甲醇淋洗，棄淋洗液，抽干SCX小柱，再用6 mL 4%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，在50℃水浴氮吹儀吹干。殘余物用0.5 mL 0.1%甲酸水溶液溶解，過濾膜后供高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取適量的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)工作液，制得 5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、400.0 ng/mL 各系列對(duì)照溶液，內(nèi)標(biāo)均為60.0 ng/mL，供高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱:Venusil MP C18(3 μm，2.1 mm ×100 mm);流動(dòng)相:A 相為含0.1%甲酸5%乙腈水溶液，B相為含0.1%甲酸95%乙腈水溶液;流速0.25 mL/min;洗脫程序:0～1 min維持5%B，1～7 min線性變化至 50%B，7～7.5 min線性變化至90%B，7.5～9 min維持90%B，9～9.5 min線性變化至5%B，并維持到15 min;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量 5.0 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;噴霧電壓(IS)5500 V，輔助氣溫度(TEM)550℃，進(jìn)樣錐孔盤加熱器(ihe)設(shè)置為on，霧化氣(GS1)壓力40 psi，輔助氣(GS2)壓力 60 psi，氣簾氣(CUR)壓力 30 psi，碰撞室(CAD)氣體壓力5 psi。

1.3.3 定性與定量 檢出物質(zhì)的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致(允許偏差為±2.5%)，并且樣品譜圖中，各定性離子的相對(duì)豐度與同等條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖相比，允許偏差符合歐盟2002/657/EC規(guī)定，則可判定樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入儀器檢測(cè)，獲得質(zhì)量濃度與響應(yīng)值(色譜峰面積)線性相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜監(jiān)測(cè)離子的選擇 在ESI中，用質(zhì)量濃度0.1 μg/mL的萊克多巴胺和D6－萊克多巴胺內(nèi)標(biāo)以針泵5.0 μL/min連續(xù)注入質(zhì)譜儀進(jìn)行全掃描，獲得［M+H］+的準(zhǔn)分子離子峰，以其作為母離子進(jìn)行轟擊，獲得碎片離子，選擇信號(hào)較強(qiáng)的兩個(gè)碎片離子和母離子組成兩對(duì)監(jiān)測(cè)離子對(duì)。在MRM模式下，進(jìn)一步優(yōu)化去簇電壓(DP)、射入電壓(EP)、碰撞能量(CE)和碰撞池出口電壓(CXP)等參數(shù)。優(yōu)化獲得的MRM離子對(duì)及質(zhì)譜條件見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜條件

2.2 樣品溶解液的選擇 樣品溶解液對(duì)萊克多巴胺峰形及靈敏度有一定的影響。本研究分別用甲醇或乙腈體積含量分別為0%、5%、10%、20%的0.1%、0.2% 甲酸配制 10.0 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC－MS－MS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，測(cè)試溶液為0.1%甲酸水時(shí)，萊克多巴胺的峰形和靈敏度最高。還將同濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC－MS－MS分析，發(fā)現(xiàn)萊克多巴胺基質(zhì)抑制效應(yīng)明顯，但用內(nèi)標(biāo)法定量可消除基質(zhì)效應(yīng)影響，因此，本試驗(yàn)采用0.1%甲酸水溶劑配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，用內(nèi)標(biāo)法定量。

2.3 方法的線性范圍 采用1.2.4項(xiàng)方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，在5.0～400.0 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，萊克多巴胺質(zhì)量濃度X與其峰面積Y的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為 Y=0.0167X+0.0158，線性相關(guān)系數(shù)為0.9994。

2.4 三個(gè)處理的試驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)測(cè)定，采用內(nèi)標(biāo)法定量，各個(gè)處理的添加回收率均在95% ～105%之間，具體數(shù)據(jù)如表2。圖1為最低濃度1#陽性樣品經(jīng)過三種不同處理后的MRM質(zhì)譜圖。3個(gè)樣品的三種處理測(cè)定結(jié)果詳見表3，從表3中可以看出，不同陽性樣品1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)的A、B、C三種處理的測(cè)定結(jié)果均有較明顯的差異，并且測(cè)定結(jié)果均是A＜B＜C，這說明三種酸解酶解的提取效果有明顯差異，采用高氯酸酸解提取效果最差，在60℃酶解2 h效果次之，在37℃酶解16 h效果最好。

表2 豬尿液中萊克多巴胺2個(gè)添加水平(ng/mL)三種處理方法回收率結(jié)果 %

表3 不同樣品不同處理的測(cè)定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

本文采用同位素內(nèi)標(biāo)法和高效液相－串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)豬尿萊克多巴胺陽性樣品進(jìn)行三種不同解離處理方法比較試驗(yàn)，結(jié)果表明，三種方法差異明顯，采用β－葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶在37℃酶解16 h效果最好，葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶在60℃酶解2 h效果次之，0.1%高氯酸酸解提取效果最差。

萊克多巴胺屬于苯酚型類受體激動(dòng)劑，它在動(dòng)物體內(nèi)代謝過程中在葡萄糖醛苷、硫酸酯等作用下發(fā)生各種軛合反應(yīng)，生成的軛合物將長期存在，在樣品提取前要通過酶解反應(yīng)來破壞這種結(jié)構(gòu)，使其結(jié)合態(tài)的待測(cè)物解離出來，而β－葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶在pH為5.2的環(huán)境中才起作用［4］。因此，采用在 pH為5.2的乙酸銨緩沖液中進(jìn)行酶解的提取效果比用高氯酸酸解提取效果好，而采用60℃酶解2 h的方法酶解還不夠。由于陽性樣品量的限制，本試驗(yàn)無法進(jìn)一步研究、優(yōu)化酶解的最佳溫度與最佳酶解時(shí)間，這有待于進(jìn)一步研究。

［1］ 農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告－4－2007，動(dòng)物組織及動(dòng)物尿液中萊克多巴胺殘留檢測(cè)方法氣相色譜－質(zhì)譜法［S］.

［2］ 農(nóng)業(yè)部1031號(hào)公告－3－2008，豬肝和豬尿中β－受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè)氣相色譜－質(zhì)譜法［S］.

［3］ 農(nóng)業(yè)部1025號(hào)－11－2008，豬尿中β－受體激動(dòng)劑多殘留檢測(cè)液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［S］.

［4］ 孫 雷，張 驪，朱永林，等.超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物源性食品中殘留的9種β－受體激動(dòng)劑［J］.色譜，2008，26(6):709－713.