吡喹酮脂質體凍干劑的制備及質量評估

鄧 昉，匡光偉，，陳啟友，唐湘北，陳小軍，張大生，隆雪明，王 慧

(1.湖南省獸藥飼料監察所，長沙 410006;2.湖南農業大學動物醫學院，長沙 410128;3.湖南省畜牧水產局，長沙 410006)

血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康、影響社會經濟發展的人畜共患寄生蟲病，流行于全世界76個國家，研究表明目前全世界約有2億人遭受感染，是一種嚴重危害人類健康的疾病之一［1－3］。近年來受我國長江季節性洪水等自然因素及人類活動頻繁等社會因素的影響，血吸蟲病疫情又出現反復，釘螺面積擴大，患病人數增加，急性感染呈上升趨勢，血防形勢嚴峻［4］。吡喹酮是用于防治血吸蟲病的首選藥物，目前臨床應用的吡喹酮制劑有片劑和膠囊，但其口服首過效應強，生物利用度低。作為靶向給藥系統的一種新劑型，脂質體(Liposome，Lip)能有效延長藥物在機體內的生物半衰期，提高療效，降低毒副作用［5－6］。然而，由卵磷脂(Soybean lecithin，PC)和膽固醇(Cholesterin，Chol)等組成的傳統脂質體屬于熱力學不穩定體系，在體內外的弱穩定性限制了其使用，極大地影響了其作為藥物載體的應用。利用冷凍干燥技術可以將吡喹酮脂質體制成凍干劑型，能在很大程度上提高其穩定性，并保持藥效。本文就吡喹酮脂質體凍干劑的制備工藝及其質量進行了研究。

1 材料

1.1 儀器與設備 高效液相色譜儀Agilent1200，Agilent科技有限公司;UV2100型紫外/可見光分光光度計，北京萊佰泰科儀器有限公司;透射電子顯微鏡JA210T型，日本Hitachi公司;旋轉蒸發儀RE252型，上海亞榮生化儀器廠;激光散射粒徑分析儀Malvern22000型，英國 Malvern公司;超聲處理機JY98230型，寧波新芝生物科技有限公司;冷凍干燥機LGJ－12立式壓蓋型，北京松源華興科技發展有限公司。

1.2 藥品與試劑 吡喹酮對照品含量99.38%，批號0046－9120，中國藥品生物制品檢定所;大豆卵磷脂，北京美亞斯磷脂技術有限公司，批號110318;膽固醇 L0281，上海科興生物科技有限公司，批號100914;吡喹酮原料含量98.6%，齊魯動物保健品有限公司提供;乙腈、甲醇為色譜純;去離子水自制。

2 方法與結果

2.1 吡喹酮脂質體凍干劑的制備 預試驗:在條件相同情況下，通過薄膜分散法、逆相蒸發法、乙醚注入法及超聲法分別制備吡喹酮脂質體。根據其包封率高低，并結合吡喹酮的性質和臨床用藥的目的、工藝的簡便程度確定薄膜超聲法制備吡喹酮脂質體［7］。

正式試驗:參考文獻［7－8］，選取卵磷脂與膽固醇質量比，加適量乙醚完全溶解后，加入吡喹酮原粉溶入其中，拌勻;置于梨形瓶中，35℃減壓旋轉蒸發，用旋轉蒸發器減壓除凈有機溶劑，在梨形燒瓶內壁形成一層均勻薄膜;加入含有適量維生素E的水合介質，搖勻，靜置1 h;再放入玻璃珠數枚，置回旋震蕩器內，震搖1～2 h洗膜，直至膜全部洗下為止，得牛奶狀多室脂質體混懸液(MLVs)。采用探頭式超聲波粉碎機進行短時超聲30 s，得吡喹酮小單室脂質體(SUVs)，裝入棕色試劑瓶中，密閉，冷凍保存［9］。同時同法同量制備一平行空白脂質體，電鏡觀察結果顯示，脂質體外觀圓整而且均勻(圖1)。

2.2 包封率的測定 結合吡喹酮本身的結構和特性，建立HPLC測定方法測定藥物的含量。

2.2.1 吡喹酮的色譜條件［10－11］Agilent ZORBAX SB C18(250 mm ×416 mm，5 μm)，流動相為乙腈 －0.1%乙酸(V∶V=4∶6)，流速1 mL/min，UV 檢測器檢測波長214 nm，柱溫30℃，進樣量20 μL。

圖1 吡喹酮脂質體凍干劑電鏡圖

方法專屬性:吡喹酮對照品、吡喹酮脂質體凍干劑和空白脂質體凍干劑典型的色譜圖如圖2～圖4所示，吡喹酮保留時間約為8.4 min，輔料對藥物無干擾。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取吡喹酮25 mg溶于無水乙醇中，定容至50 mL，得0.5 mg/mL吡喹酮溶液。精密吸取該溶液 1、2、4、6、8、10 mL，分別置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，得濃度為 5、10、20、30、40、50 μg/mL 的溶液，用HPLC測定藥物的峰面積。將濃度(X)與峰面積(Y)進行線性回歸，得Y=300000X+24552，相關系數R ＞0.999，吡喹酮在濃度為 5 ～50 μg/mL 的范圍內線性關系良好，檢測限為0.06 μg/mL。

2.2.3 加樣回收率 將脂質體凍干劑解凍，分別準確量取0.2、0.4、0.8 mL 脂質體樣品，用葡聚糖凝膠柱分離，用無水乙醇小心洗脫，接取洗脫液25 mL，該測定方法的加樣回收率為(98.4±1.5)%(n=3)。

2.2.4 樣品包封率測定 采用葡聚糖凝膠(Sephadex)柱色譜法［12］，將吡喹酮脂質體凍干劑解凍，精密吸取吡喹酮脂質體混懸液0.5 mL上柱，以乙腈－0.1%乙酸混合溶液為流動相洗脫，控制流速，每1.0 mL收集一試管，流出液管數與吸光度值曲線如圖5所示。

圖5 吡喹酮脂質體洗脫曲線

根據Sephadex G250對大分子先被洗脫出來、小分子后出來的順序，收集合并游離的吡喹酮于100 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，HPLC測定峰面積，計算游離吡喹酮含量。另精密吸取吡喹酮脂質體混懸液0.5 mL，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇破膜并定容至100 mL，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，除去脂質體碎片，取濾液，用HPLC測定峰面積，求得藥物含量，按下式計算包封率:包封率=(1－游離藥物含量/系統中的藥物總含量)×100%。

采用上述測定包封率的方法，檢驗3批吡喹酮脂質體凍干劑樣品的包封率，包封率分別為(72.3±2.1)%、(73.2 ±2.7)%、(74.5 ±1.8)%(n=3)。

2.2.5 吡喹酮脂質體凍干劑的穩定性考察

2.2.5.1 抗光解性實驗 分別稱取吡喹酮脂質體凍干劑和吡喹酮各若干份，照射10 d(強度3000 LX)，于 0、1、3、5、10 d 取樣測定含量。結果表明，包合物抗光解性優于吡喹酮(表1)。

表1 吡喹酮脂質體凍干劑和吡喹酮抗光解性試驗結果

2.2.5.2 熱穩定性實驗 分別精密稱取吡喹酮脂質體凍干劑和吡喹酮各若干份，密封于玻璃瓶中，分別于40、60、80℃恒溫干燥箱內放置10 d，于0、1、3、5、10 d取樣測定含量。結果表明:吡喹酮脂質體凍干劑的熱穩定性明顯優于吡喹酮(表2)。

表2 吡喹酮脂質體凍干劑和吡喹酮抗熱穩定性試驗結果

2.2.5.3 濕穩定性實驗 分別精密稱取吡喹酮脂質體凍干劑和吡喹酮適量，置入兩個密閉器皿中，相對濕度分別為75%(NaCl)和92.5%(KNO3)，于室溫放置10 d，于0、1、3、5、10 d 取樣測定含量。結果表明，在高濕條件下，吡喹酮脂質體凍干劑較吡喹酮穩定(表3)。

2.2.6 脂質體的粒徑參數 測定3批吡喹酮脂質體凍干劑的粒徑，結果分別為(237±5.5)、(254±4.9)、(249 ±6.1)nm。

2.2.7 凍干工藝及質量評價 由于主要膜材磷脂易氧化、水解，脂質體混懸液在儲存期間易發生聚集、融合及藥物滲漏，因此難以滿足藥物制劑穩定性的要求，限制了其應用。本研究將脂質體混懸液制成凍干粉劑，采用甘露醇作為凍干保護劑，分別制成5%、10%、15%(W/V)三個不同濃度的脂質體進行凍結并冷凍干燥，通過比較各脂質體凍干再水化后的形態和粒徑變化、凍干品外觀及包封率的變化來選擇保護劑的最佳比例，以期提高脂質體的穩定性(表4)。

表3 吡喹酮脂質體凍干劑和吡喹酮抗濕穩定性試驗結果

表4 不同濃度凍干保護劑對包封率和粒徑的影響

3 討論

研究表明，制成凍干脂質體可顯著降低磷脂和藥物的氧化及水解速度，同時，凍干保護劑可克服脂質體聚集、融合及藥物滲漏等不穩定因素，保持脂質體膜結構的完整性，顯著提高貯存穩定性［2］。該法與Vanleberghe報道采用冷凍干燥法提高脂質體的貯存穩定性相符［13－14］，已成為較有前景的改善脂質體制劑長期穩定性的方法之一。脂質體在室溫條件下短期內存放較穩定，但隨著存放時間的延長，穩定性有所下降，建議在－20℃冰箱中冷凍保存。

脂質體凍結過程中形成的冰晶不僅會對脂質體囊泡造成損害，而且會影響熱量的傳遞及水蒸氣的逸出。凍干品復水化后，大量的水透過脂質體脂質雙分子層，會導致藥物滲漏，包封水溶性藥物的大單室脂質體這種現象尤其嚴重。如果在凍干前加入適宜的凍干保護劑，同時采用適宜的工藝，則可大大減輕、甚至消除凍干對脂質體的破壞。

隨著生物工程技術的日益發展，生物醫藥產品，例如多肽、蛋白質、酶及核酸類藥物的不斷增多，藥物的給藥穩定性安全性成為藥物研發中迫切需要解決的重大難題。脂質體作為這類藥物的常用載體，可以提高該類藥物的穩定性、療效及安全性。然而由于脂質體制備工藝較復雜，且不易擴大生產，同時凍干品的長期穩定性也還有待于進一步提高，脂質體的凍干工藝和凍干保護機理等還有待進一步研究。

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