丙戊酸體內分析方法研究進展Δ

毛桂福

（柳州市婦幼保健院藥劑科，廣西柳州 545001）

丙戊酸體內分析方法研究進展Δ

毛桂福＊

（柳州市婦幼保健院藥劑科，廣西柳州 545001）

目的：綜述丙戊酸的體內分析方法，為丙戊酸的臨床藥學研究提供方法學參考。方法：通過查閱大量國內、外文獻，總結了常用儀器分析方法在丙戊酸體內分析中的應用進展。結果：丙戊酸體內藥物濃度的分析方法有多種，常用有高效液相色譜法、液質聯用技術、氣相色譜法、高效毛細管電泳法和熒光偏振免疫分析法等。結論：目前最常用的分析方法為熒光偏振免疫分析法和高效液相色譜法；隨著液質聯用儀的普及，分離效率高、分析速度快的液質聯用技術有望成為血藥濃度監測的主要方法。

丙戊酸；體內分析；高效液相色譜法；液質聯用；氣相色譜法；高效毛細管電泳法；熒光偏振免疫分析法；均相酶免疫分析法

丙戊酸（Valproic acid，VPA）是一種廣譜抗癲癇藥，對全身性癲癇的失神發作、肌陣攣發作和強直性陣攣發作有效，對單純部分性發作和復雜性部分發作也有一定療效。VPA的治療濃度范圍窄、個體差異大，治療過程中須監測血藥濃度，以達到個體化合理用藥之目的。VPA分子無特征性的紫外吸收，其血藥濃度的測定一直是體內藥物分析的難點。本文系統歸納了現有的VPA分析方法，特別是對衍生化高效液相色譜（HPLC）法進行了詳細闡述。

1 HPLC法

HPLC法是20世紀70年代發展起來的一種定量分析方法，具有準確、專屬性強、重現性好等優點，在藥物的體內分析領域有廣泛應用。由于VPA分子結構缺乏生色基團，HPLC法監測VPA的血藥濃度，大多需要將VPA柱前衍生化生成具有紫外吸收或熒光的酯類，再用紫外檢測器、二極管陣列檢測器或熒光檢測器等檢測。常用的紫外檢測波長有248、254、262、300 nm等。不經過柱前衍生化處理而直接測定的高效液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV）法[1]報道較少。

血樣中VPA通常采用液-液萃取法提取。由于VPA的p Ka值為4.95，血樣一般需用硫酸或鹽酸等酸化處理。常用的萃取溶劑有正戊烷、正己烷、乙醚、氯仿、二氯甲烷和乙腈等，或它們的混合溶劑。衍生化后的溶液經固相萃取法處理，可除去反應液中殘余的衍生化試劑，減少衍生化試劑對測定的干擾，有利于色譜柱的保護。

柱前衍生化-HPLC法測定血清中VPA，通常采用C18柱，以甲醇-水或乙腈-水等二元流動相進行分離，并常用環己烷羧酸、1-環己烷烯羧酸、正庚酸、辛酸、壬酸、十一碳烯酸等作內標。該方法主要的區別是樣品預處理過程中衍生化方法的不同，各衍生化條件詳見表1。常用的衍生化試劑有α-溴苯乙酮、2，4′-二溴苯乙酮（DBrMP）、2-溴-對硝基苯乙酮、4-溴甲基-7-甲氧基香豆素（BrMMC）、4-溴甲基-6，7-二甲氧基香豆素（BrDMC）、N-（1-萘基）乙二胺和2-（2-萘氧基）乙基-2-（哌啶）乙磺酸酯等。衍生化試劑、催化劑、反應溫度、反應時間以及氮氣流速等直接影響VPA衍生物的生成，進而影響VPA的測定[2，3]。常見的柱前衍生化-HPLC法分述如下。

1.1 α-溴苯乙酮衍生化法

付翠香等[2]用α-溴苯乙酮作衍生化試劑建立了HPLC法測定VPA血藥濃度。VPA濃度在15～200μg·mL－1范圍內線性關系良好，平均回收率、RSD都能滿足測定要求，最低檢測濃度為0.2μg·mL－1。三乙胺作為催化劑能中和反應中生成的溴化氫，使VPA酯化完全。適當增加衍生化試劑用量有助于增加VPA衍生物的生成量，但過多不利于色譜柱的保護。苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平等抗癲癇藥對測定無干擾。該方法國內外文獻報道[3，4]較多，樣品處理方法大多類似。

1.2 DBr MP衍生化法

Chen等[5]用DBrMP作衍生化試劑建立了HPLC法測定血漿中VPA和主要代謝物2-丙基-4-戊烯酸的濃度。兩者分別在5～200μg·mL－1和0.5～20μg·mL－1范圍內有良好的線性關系，最低定量限分別為5μg·mL－1和0.5μg·mL－1，日內和日間RSD在－3.0%～7.5%范圍內。

1.3 2-溴-對硝基苯乙酮衍生化法

表1 HPLC測定血清中丙戊酸的衍生化條件

石蘇英等[6]建立了測定VPA血藥濃度的HPLC法。血清樣品經正己烷提取后，加入2-溴-對硝基苯乙酮在50℃水浴中放置15 min即可完成衍生化反應。VPA的最低檢測限為0.2μg·mL－1，提取回收率為83.0%～86.3%。周莉華等[7]也采用2-溴-對硝基苯乙酮作衍生化試劑建立了HPLC法測定VPA的血藥濃度。

1.4 Br MMC衍生化法

陳湛芳等[8]采用BrMMC作衍生化試劑建立了HPLC-UV法測定VPA血清濃度。VPA的衍生化反應需用含10 mg·mL－1碳酸鉀的冠醚混懸液催化，于65℃水浴避光反應30 min。衍生物在－20℃避光儲放1周或室溫避光儲放72 h穩定，血樣在－30℃凍存3個月基本穩定。Gill等[9]以環己烷羧酸為內標、BrMMC為衍生化試劑，建立了HPLC-熒光法測定VPA血漿濃度，激發波長和發射波長分別為330 nm和395 nm。最低定量濃度為2.47μg·mL－1，批內和批間RSD≤8.6%。并用該方法進行了3種VPA腸溶片的生物等效性研究。

1.5 Br DMC衍生化法

趙俠等[10]通過用BrDMC與VPA衍生化，建立了HPLC-熒光檢測法測定VPA的血藥濃度，衍生化需在60℃水浴中反應40 min，冷卻后用熒光檢測器檢測，激發波長為325 nm，發射波長為398 nm。VPA的最低定量限為1 mg·L－1。該方法靈敏度高、專屬性好，并用于VPA口服溶液生物等效性的研究。

1.6 N-（1-萘基）乙二胺衍生化法

Kamalinia等[11]通過VPA與N-（1-萘基）乙二胺衍生化，建立HPLC法測定了VPA的血藥濃度。在100μL N，N′-二環己基碳酰亞胺（5 mg·mL－1）和N-羥基丁二酰亞胺（二者物質的量之比為1∶3.6）的催化下，衍生化反應于85℃水浴中保溫60 min即可完成。衍生物在室溫放置3 d仍穩定；VPA在0.1～100μg·mL－1濃度范圍內線性關系良好，檢測限為10 ng·mL－1。該方法比以往報道的HPLC-UV法和HPLC-熒光檢測法都靈敏，但反應時間太長，且所用溶劑都需要經過硫酸鈉干燥。

2 液-質聯用（LC-MS）技術

LC-MS技術是最近幾年才發展起來的一種新的分析方法，具有高效、靈敏、特異性強等優點，其缺點是需要昂貴的儀器設備和具有高技術水平的工作人員。楊學志等[12]建立LC-MS法測定人血清中VPA濃度：采用Zorbax SB C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5μm），以乙腈-水（60∶40）為流動相，流速0.3 mL·min－1，柱溫30℃，血漿樣品經乙腈沉淀蛋白后進樣分析。采用電噴霧電離源（ESI）負離子源，用選擇離子監測方式進行定量分析。VPA在0.5～100μg·mL－1濃度范圍內線性關系良好，最低檢測濃度為0.1μg·mL－1。該方法操作簡單、結果準確、靈敏度高、耗時少，適用于VPA血藥濃度監測及藥動學研究。Gao等[13]和Matsuura等[14]也建立了液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法測定人血中VPA或代謝物的濃度。

3 氣相色譜（GC）法

GC法是最早發展起來的一種儀器分析方法，具有分離效能高、靈敏度高、用樣量少等優點。由于VPA具有一定的揮發性和熱穩定性，早期監測其血藥濃度應用GC法較多。張華年等[15]用程序升溫毛細管GC法監測VPA血藥濃度。選用ATSE-54石英毛細管色譜柱（21 m×0.53 mm，1.0μm）為色譜柱，用火焰離子化檢測儀（FID）檢測VPA血藥濃度。VPA在20～300 mg·L－1范圍內線性關系良好，最低檢測濃度為1 mg·L－1，相對回收率在96%以上，日內和日間RSD＜7.6%。該方法不需要衍生化處理樣品，操作簡便、準確可靠，但一個測定周期仍需耗時1 h左右。Farajzadeh等[16]用固相微萃取毛細管GC法檢測人血中VPA的濃度，該方法線性范圍寬（0.25～100 mg·L－1），檢測限低（85μg·L－1），RSD＜7%。

4 高效毛細管電泳（HPCE）法

HPCE法是近年來發展較快的一種新型高效快速的分離分析技術，具有分辨率和靈敏度高、快速、耗費低、樣品預處理簡單等特點。Belin等[17]以己酸為內標建立毛細管電泳法測定體液中VPA：血樣經乙腈沉淀蛋白后，采用石英毛細管柱（50μm×50 cm）分離，以10 mmol·L－12-（N-嗎啉代）乙磺酸/DL-組氨酸溶液（pH 6.0，含50μmol·L－1西曲溴銨）為電泳緩沖液，分離電壓30 kV，電泳時間3 min，虹吸方式進樣10 s，電容耦合非接觸電導檢測器檢測。結果VPA在2～150μg·mL－1濃度范圍內具有良好的線性關系，最低檢測濃度為80 ng·mL－1。

5 熒光偏振免疫分析（FPIA）法

FPIA法具有自動化程度高、不需要樣品處理、簡便快速等優點，是目前國內外監測血藥濃度選擇的主要方法。其缺點是設備、試劑價格較高。2010年孔晶等[18]對監測VPA血藥濃度的FPIA法進行了質量評價，結果表明平均回收率及相對標準差等符合《中國藥典》對生物樣品測定方法的規定。唐榮福等[19]用FPIA FLX法檢測了2～8℃冰箱中儲存不同時間的VPA血清樣品，結果表明，血清中VPA放置1周內穩定，放置2周后不穩定。

6 均相酶免疫分析（EMIT）法

EMIT法是利用抗原（藥物）及標記抗原（葡萄糖-6磷酸脫氫酶標記的藥物）競爭與抗體相互識別、結合來產生檢測信號的。EMIT法自動化程度高、無需對樣品預處理，適用于急診及批量測定，但該法儀器和試劑成本較高。黃文鶯等[20]以EMIT法采用全自動免疫分析儀測定了VPA血藥濃度，并與HPLC的測定結果進行比較。結果VPA在1～150 mg·L－1濃度范圍內時，HPLC和EMIT兩種方法的準確度無顯著性差異，但HPLC法精密度更好；兩種方法測定結果存在高度相關性，但是當測定標本的VPA濃度小于10 mg·L－1時宜用HPLC法測定。

7 小結

目前，測定VPA血藥濃度最常用的方法是FPIA法和HPLC法。FPIA法具有簡便快速等優點，但需用專用儀器及試劑盒，耗費較多，且VPA代謝產物對測定有干擾，該方法難于在基層醫院推廣使用。而HPLC法需要柱前衍生化，操作煩瑣，不適于大批量樣品測定；但HPLC儀在國內較普及，測定結果準確，因而該方法在基層單位仍廣泛應用。衍生化試劑、催化劑、反應溫度和時間以及氮氣流速等影響VPA衍生化反應，因此需對這些因素進行考察，從而確定最佳反應條件，以保證測定結果的準確性、重復性。LC-MS法具有分離效率高、不需要衍生化處理等優點，隨著LC-MS儀的普及，LC-MS法有望成為VPA血藥濃度監測的主要方法。

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R914

A

1001-0408（2012）46-4393-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.46.28

2011-12-07

2012-06-11）