小鼠抗食蟹猴IgG單克隆抗體的制備

張段玲，張彥龍，白素英

(東北林業大學，哈爾濱 150040)

小鼠抗食蟹猴IgG單克隆抗體的制備

張段玲，張彥龍，白素英

(東北林業大學，哈爾濱 150040)

目的 制備抗食蟹猴、恒河猴等非人靈長類實驗動物免疫球蛋白二級抗體，開展對其傳染病血清學快速診斷方法的建立。方法 采用飽和硫酸銨鹽析、Agarose-Protein G親和層析技術，從食蟹猴血清中提純 IgG。經SDS-PAGE電泳鑒定，采用常規法免疫C57BL/6小鼠，三次免疫后取脾細胞與 Sp2/0-Ag14骨髓瘤細胞通過PEG4000融合制備雜交瘤細胞，利用間接ELISA、Western blot等方法進行篩選、鑒定。結果 得到5株陽性雜交瘤，分別命名為2B6、2B7、2D9、3B2、5E4，并且5株雜交瘤分泌的抗體均與恒河猴的 IgG或血清發生交叉反應，而與其他物種如東北虎、犬等動物的IgG或血清無交叉反應。結論 5株雜交瘤產生的單克隆抗體(McAb)具有較好免疫活性，且能長期、穩定地分泌抗體。此項研究工作為后續研究食蟹猴、恒河猴傳染病血清學診斷方法奠定基礎。

食蟹猴;IgG;單克隆抗體;親和層析

食蟹猴(Macaca fascicularis)屬于靈長目(primates)猴科(Cercopithecidae)獼猴屬。現階段我國養殖的實驗猴主要是獼猴屬的食蟹猴和恒河猴，其中食蟹猴為外來種，兩者均被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約(CITES)》附錄Ⅱ中［1］。獼猴屬動物親緣關系上和人類比較接近，與人類遺傳物質有75%～98.5%的同源性，是研究人類疾病的理想動物模型，被廣泛的應用于傳染病、遺傳性疾病、心血管疾病、內分泌疾病、藥理學和毒理學等研究領域［2－4］。但是食蟹猴及其他非人類靈長類患病種類繁多，如 B病毒、猴痘、猴結核、猴副流感、麻疹病毒病、肝炎病毒病等［5－8］。因此需要建立相應的診斷方法，以便對所用實驗猴進行徹底的檢查，排除疾病個體。目前我國雖然已建立一些診斷方法，但仍沒有一個完善的方法滿足實驗猴疾病的排查和篩選，血清學方法是診斷疾病的有效手段之一，制備抗免疫球蛋白二級抗體是開展血清學診斷研究工作的前提。

本文針對食蟹猴IgG制備其單克隆抗體，并鑒定此抗體與恒河猴免疫球蛋白抗原相關性，為以后開展非人靈長類動物疾病血清學診斷方法及診斷試劑盒的研制奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 食蟹猴血清、細胞及實驗動物

食蟹猴血清由東北林業大學野生動植物檢測中心白素英老師惠贈［SCXK(瓊)2004-0001］。SP2/0骨髓瘤細胞，本實驗室保存。C57BL/6小鼠，購自哈爾濱醫科大學腫瘤防治研究所［SCXK(黑)2005-2007］。

1.2 試劑

鑒定 McAb 的亞型診斷試劑盒為SBA ClonotypingTMSystem/HRP，SouthernBiotech，Cat．No．5300-05;RPMI-1640 培 養 基，GIBCO，Cat．No．3180022;HATMediaSupplement(50×)Hybri-MaxTM，Sigma，Cat．No．H0262;HT Media Supplement(50 × )Hybri-MaxTM Sigma，Cat．No H0137;Anti-Mouse IgG，Sigma，Cat．No A4416;Freund’s complete adjuvant(FCA)Sigma， Cat． No． F5881;OPhenylenediaminedihydrochloride(OPD)，Sigma，Cat．No P9187。

1.3 IgG制備及純度鑒定

采用飽和硫酸銨鹽析和Agarose-Protein G親和層析分離純化，按文獻［9］的方法，取10 mL食蟹猴血清和40 mL冷的50 mmol/L PBS(pH7.2)緩沖液，在冰上加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，最終濃度在22%，離心去除沉淀，上清液繼續加入硫酸銨粉末終濃度55%，在4℃下放置4 h，離心回收沉淀，并溶解在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，透析在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中，中間三次換液并過夜透析。次日回收透析液，離心除去不溶物。上清液加入硫酸銨粉末至終濃度33%，在4℃下攪拌并靜止4 h，離心收集沉淀，透析于20 mmol/L磷酸鹽中，換液3次并過夜，回收透析液，并12000 rpm離心10 min，去掉不溶性蛋白備用。層析法是將Agarose-PreoteinG在超純水中膨脹30～60 min后裝柱，經5～10倍體積的20 mmol/L磷酸鹽平衡后，上柱、洗脫，并收集洗脫液定量。用SDS-PAGE對提純的IgG純度進行鑒定，純化后的IgG－80℃保存。

1.4 小鼠免疫及細胞融合

取6～8周齡雌性 C57BL/6小鼠，初次免疫為FCA乳化抗原，皮下多點注射，抗原用量為250 ug/只，間隔2周，進行FIA加強免疫1次，第3次用純化的IgG腹腔直接免疫，4 d后取脾臟，分離細胞，骨髓瘤細胞1×107個/mL與已免疫的小鼠脾細胞1×108個/mL混合，用 50%的 PEG4000/RMPI-1640進行融合制備雜交瘤。

1.5 雜交瘤細胞的篩選

按常規間接ELISA方法，融合10 d后，以100 ng/孔純化后的食蟹猴IgG作檢測抗原包被ELISA板，3%BSA封閉1 h，取融合細胞上清液進行檢測，并以SP2/0培養上清和免疫小鼠血清分別做陰陽性對照，加二抗，顯色，ELISA讀數，判定標準為P/N＞2.1為陽性。采用有限稀釋法對所選擇陽性雜交瘤細胞進行連續3次克隆，3次克隆化后結果均為陽性者，判斷為能穩定分泌抗食蟹猴IgG抗體的雜交瘤細胞株。擴大培養并分批凍存雜交瘤細胞。

1.6 單克隆抗體(McAb)的免疫原性檢測

McAb的免疫原性通過Western blot檢測，取純化后及粗提的食蟹猴 IgG進行 SDS-PAGE;通過半干轉移法轉移到 PVDF膜上，3%BSA 37℃封閉1 h;在搖床上用 PBST洗膜5次，然后分別與雜交瘤2B6、2B7、2D9、3B2、5E4上清 37 ℃ 作用 1 h，清洗;再與HRP標記的羊抗鼠 IgG 37℃作用1 h，清洗;ECL-Kit顯色后，立即暗室曝光、洗相。

1.7 McAb腹水制備及效價的測定

按照常規方法，選8～10周齡 C57BL/6小鼠腹腔每只注射0.5 mL液體石蠟。7 d后，以1×106個雜交瘤細胞/mL，0.5 mL每只小鼠，腹腔注射。一般7～10 d左右，便可以采集腹水。取得腹水后，腹水經離心、硫酸銨沉淀、Protein G-Agarose親合層析純化得到純度較高的單克隆抗體。然后通過間接ELISA方法進行效價測定，100ng/孔包被食蟹猴IgG，方法同雜交瘤細胞的篩選。

1.8 McAb特異性鑒定

通過間接ELISA，以犬血清、貉血清、東北虎血清、恒河猴血清各50 uL/孔以及純化后的 IgG各100 ng/孔作為抗原包被酶標板，以雜交瘤培養上清為一抗，方法同雜交瘤細胞的篩選。同時以純化后的犬、貉、東北虎、獼猴免疫球蛋白，通過 SDS-PAGE電泳與 Western blot鑒定 MAb的特異性，方法同McAb的免疫原性檢測。

1.9 McAb亞型鑒定

單克隆抗體的亞型的鑒定，參照 SBA ClonotypingTMSystem/HRP說明書所描述方法進行操作。

2 結果

2.1 SDS-PAGE鑒定IgG

經飽和硫酸銨沉淀得粗提食蟹猴IgG和經Protein G-Agarose親和層析后食蟹猴IgG通過SDSPAGE電泳后，結果如圖1所示，重鏈的分子量約55×103，輕鏈約28×103，符合哺乳動物的 IgG的分子量。

2.2 McAb免疫活性檢測

采用Western blot法檢測5株單克隆抗體與粗提、純化后的食蟹猴 IgG的結合活性，結果表明2B6、5E4、2B7、2D9、3B2均與重鏈反應，5 株雜交瘤均具有良好的免疫活性。

圖1 SDS-PAGE IgG鑒定Fig．1 SDS-PAGE identify the IgG

2.3 McAb腹水效價

小鼠腹水經純化后，2D9、3B2的腹水效價分別為 1∶25600，1∶51200。2B7、5E4、2B6的 ELISA 效價為1∶12800，雜交瘤細胞經多次傳代凍存復蘇，誘生腹水抗體分泌特性穩定。

2.4 McAb特異性鑒定

McAb與純化后的食蟹猴、恒河猴 IgG，食蟹猴血清、恒河猴血清均反應，而與東北虎、犬的血清及其IgG均不反應。說明食蟹猴與恒河猴IgG具有相同的抗原表位，如表1可見。

2.5 McAb亞型鑒定

用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒測定雜交瘤細胞培養上清中單克隆抗體的亞型，結果表明5E4、2B6、2B7為 IgG2b 型，3B2為 IgG3 型，2D9為 IgG1 型。2B7、2B6、5E4、2D9輕鏈均為 κ 型，3B2 為 λ 型。

表1 ELISA鑒定結果Tab．1 Result of ELISA evaluation

3 討論

據2009年統計，我國實驗猴的存欄量21萬只，其中恒河猴近3萬只，食蟹猴18萬余只［11］。食蟹猴、恒河猴因與人類有很近的親源關系，遺傳基因相似，廣泛應用于人類醫學研究，是重要的動物實驗模型，但是由于攜帶多種疾病，因此需要加強非人靈長類的疾病檢測，保證實驗順利開展至關重要。

為此，從食蟹猴血清中，通過飽和硫酸銨沉淀和親和層析技術，由SDS-PAGE檢測結果表明所得到的食蟹猴IgG純度較高。雖然粗提條帶相對于親和層析有少量雜帶，但其純度仍相當客觀，所以在需要制備大量粗提抗體時，加入固體飽和硫酸銨沉淀法從儀器設備、溫度、價格、活性、純度等方面考慮，有很大優勢，值得推廣使用。而親和層析法相對于其他提純方法價格雖比較昂貴，但其可以在簡單的試驗條件里，快速得到所需高純度樣品。二者聯合運用，即經濟，效果也客觀，在制備各種動物免疫球蛋白二級抗體方面，可優先考慮。

本研究利用細胞融合技術，成功制備了5株能穩定分泌抗食蟹猴IgG的雜交瘤細胞。從單克隆特異性鑒定結果表明，每孔均包被100 ng純化后的IgG，這5株雜交瘤所分泌單克隆抗體均與食蟹猴、恒河猴純化后的IgG、血清反應，差別是血清反應性較純化的IgG弱些，有可能跟血清中IgG相對濃度比純化后的濃度低有關。食蟹猴、恒河猴兩個物種的反應強度相似，說明食蟹猴、恒河猴IgG具有較高的共同抗原表位。這可能與它們親緣關系較近有關。單克隆抗體為以后研究這兩種實驗動物疾病血清學診斷、人IgG特性比對，提供了基礎。

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Preparation Monoclonal Antibodies Of Mice Against Macaca fascicularis IgG

ZHANG Duan-ling，ZHANG Yan-long，BAI Su-ying
(Northeast Forestry University，Harbin 150040，China)

ObjectiveIn order to prepare immunoglobulin G(IgG)secondary antibody of non-human primates such as Macaca fascicularis and Macaca mulatta and establish a quick serological method to diagnose their diseases．MethodsMacaca fascicularis IgG was isolated and purified from Macaca fascicularis serum by precipitated use saturated ammonium sulfate and affinity chromatography technology with Agarose-Protein G．After identified by SDS-PAGE electrophoresis murine monoclonal antibody(McAb)were produced by conventional immune method and hybridoma technology．Monoclonal antibody was produced when C57BL/6 mice was immunized three times and its spleen cells were fused with SP2/0-Ag14 myeloma cells．Indirect ELISA and Western blot methods were used for identification．Result5 strains of myeloma cells acquired which were named 2B6，2B7，3B2，5E4，2D9．The antibodies they secret can all react well with both IgG and their serum of Macaca fascicularis and Macaca mulatta．There are no cross reaction with other species such as east-northern tigers and dogs．ConclusionThe 5 strains of monoclonal antibodies can secrete antibody chronically and steadily．The study can be valuable in establishing a quick serological method in diagnosing the infectious disease．

Macaca fascicularis;IgG;Affinify chromatography;Monoclonal antibody

R332

】A

1671-7856(2012)05-0068-04

10．3969/j．issn．1671．7856．2012．05．015

國家林業局疫源疫病監測項目《我國境內不同種屬猴免疫球蛋白同源性分析及其單克隆抗體的制備》。

張段玲(1988－)，女，碩士，研究方向:動物傳染病。

張彥龍(1968－)，E-mail:zhangynlng@yahoo．com．cn。

2012-03-23