堿性成纖維細胞生長因子對神經干細胞分化為星形膠質細胞的影響

王豐，屠冠軍，朱悅

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽110001）

神經干細胞在脊髓損傷后神經再生的研究中是倍受關注的焦點。神經干細胞移植后在局部分化成神經元和膠質細胞，有望促進脊髓損傷后的神經再生和功能恢復。星形膠質細胞在中樞神經系統疾病修復過程中扮演著重要角色。不同類型的星形膠質細胞具有不同的功能，本研究觀察堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對大鼠脊髓來源神經干細胞分化形成星形膠質細胞的影響，為神經干細胞定向分化研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生后24 h內的Wistar大鼠由中國醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑

表皮生長因子EGF（epidermal growth factor）和nestin兔抗鼠單克隆抗體購自Chemicon公司；堿性成纖維細胞生長因子bFGF、DMEM/F12培養(yǎng)基、B27、Alexa Fluor?488羊抗兔熒光二抗、PI和Zenon Tricolor熒光標記試劑盒均購自Invitrogen公司；兔抗鼠神經元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗體購自武漢博士德公司。

1.3 神經干細胞的分離和培養(yǎng)

取4只出生24 h內的Wistar大鼠，處死后在超凈臺內取出大鼠脊柱，以眼科剪刀剪開椎板，取出脊髓置入裝有4℃D-Hanks液平皿中。將脊髓剪碎，清洗后加入0.125%胰蛋白酶37℃消化40 min，離心棄去胰酶，加入添加有B27、20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF的DMEM-F12培養(yǎng)基，重懸浮，200目細胞篩過濾后接種于培養(yǎng)瓶中（1×108/L），置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4 d更換培養(yǎng)液。

1.4 神經干細胞的鑒定

1.4.1 Nestin免疫熒光染色：培養(yǎng)1周后，取神經球以冷丙酮固定10min，滴在載玻片上烘干，0.01mol/L PBS漂洗3次，5%BSA封閉15 min，棄去血清滴加nestin兔抗鼠單克隆抗體，以PBS代替一抗作為對照，4℃過夜。0.01 mol/L PBS漂洗3次，滴加5 μg/mL Alexa Fluor?488羊抗兔熒光二抗，避光室溫孵育1 h。PBS漂洗3次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察照相。

1.4.2 誘導分化：取神經球盡量吹打分散成單細胞，將神經干細胞懸液加入預先已置入玻璃蓋片的6孔培養(yǎng)板中，加入10%胎牛血清。3 d后取出蓋片，分別以NSE，GFAP和MBP抗體標記，PI標記細胞核，常規(guī)方法免疫熒光染色。

1.5 bFGF對神經干細胞分化形成星形膠質細胞影響的觀察

取神經球盡量吹打分散成單細胞，將神經干細胞懸液加入預先已置入玻璃蓋片的6孔培養(yǎng)板中，分為A組和B組。A組加入10%胎牛血清，B組加入10%胎牛血清和20 ng/mL bFGF。1～7 d每天取出蓋片，進行GFAP熒光標記，PI標記細胞核。熒光顯微鏡下觀察照相，計數陽性細胞數和總細胞數，觀察星形膠質細胞形態(tài)，將其分類，計算各種星形膠質細胞亞型的比率。使用Image-Pro Plus5.0軟件進行星形膠質細胞突起長度的測量。每次實驗在200倍熒光顯微鏡下隨機選取10個視野進行測量，實驗重復3次，取平均值。

2 結果

脊髓來源的神經干細胞生長相對較慢。取材3 d后培養(yǎng)瓶中可以觀察到含有10余個細胞的細胞團，1周后細胞團逐漸長大并有典型的神經球出現，2周后培養(yǎng)瓶內可見大量神經球。神經球nestin表達陽性（圖1A）。

神經球分化3 d后，分化細胞的形態(tài)趨于成熟，可以識別出部分具有典型形態(tài)的神經元和膠質細胞。經免疫熒光染色可觀察到NSE、GFAP和MBP標記陽性的細胞（圖1B～D）。NSE、GFAP和MBP分別是神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的標志物，這表明培養(yǎng)出的神經球具備分化成神經元，星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力，是神經干細胞。

GFAP是成熟星形膠質細胞的標志物，分化7 d，A組和B組GFAP陽性的細胞比率分別為（64.3±3.31）%和（60.6±2.54）%，差異無統計學意義。A組和B組均可觀察到4種形態(tài)顯著不同的GFAP+細胞（圖2A～D）。圖2A所示的星形膠質細胞胞體延長，細胞突起明顯，分支較少或沒有分支，A組中占GFAP+細胞的（2.39±0.13）%，B 組中占 GFAP+細胞的（2.24±0.15）%；圖2B所示的星形膠質細胞胞體扁平，呈多角形，胞體巨大，可以是其他類型星形膠質細胞數倍大小，沒有或很少有突起，A組中占GFAP+細胞的（32.33±2.01）%，B 組中占 GFAP+細胞的（31.16±0.21）%；圖2C所示的星形膠質細胞具有較小的細胞體，星狀的突起分支多而明顯，A組中占 GFAP+細胞的（59.88±3.12）%，B 組中占 GFAP+細胞的（60.57±0.23）%；圖2D所示的星形膠質細胞為雙極細胞，兩側各有一細長突起，沒有分支，A組中占 GFAP+細胞的 （5.39±0.27）%，B 組中占GFAP+細胞的（6.03±0.13）%。A組和B組中各個亞型的比率差異無統計學意義，形態(tài)基本一致。B組中雙極細胞的突起長度明顯超過A組（圖3）。經顯微測量，A組中雙極細胞突起平均長度為（50.73±1.25）μm，B組中雙極細胞突起平均長度為（230.96±4.13）μm，兩者差異有統計學意義（P<0.01）。

3 討論

神經干細胞具有自我更新和多分化潛能屬性，可分化產生神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，這使得神經干細胞移植替代神經系統疾病中丟失的細胞成為可能。治療不同的神經系統疾病需要將神經干細胞定向分化為不同類型的細胞，這些在神經干細胞治療疾病和盡可能減少不良反應方面顯得十分重要。以往研究者多致力于促進神經干細胞分化形成神經元，以替代神經系統疾病或損傷中破壞的神經元，恢復神經功能。星形膠質細胞一度被忽視，脊髓損傷后星形膠質細胞形成的瘢痕曾被認為是軸突再生不可逾越的障礙［1］，然而在體外培養(yǎng)實驗中，星形膠質細胞具有合成和分泌營養(yǎng)因子的功能，可以促進神經元的軸突生長［2］?，F在認為星形膠質細胞對再生軸突具有阻礙軸突穿越和分泌神經營養(yǎng)因子促進軸突再生的雙重作用［3］。隨著人們對其多樣性和功能的復雜性逐漸認識，星形膠質細胞的分類和功能重新成為研究的熱點和難點，神經干細胞定向分化成星形膠質細胞的工作也逐漸開展。神經干細胞分化形成的星形膠質細胞不僅可以補充和替代中樞神經系統損傷區(qū)的細胞，還可以維持神經元的存活和促進軸突的生長，甚至可以作為藥物載體長期發(fā)揮治療作用［4，5］。

微環(huán)境在神經干細胞定向分化調控中起重要作用，細胞外基質中的成分對神經干細胞分化形成星形膠質細胞的影響是微環(huán)境調控的研究熱點［6］。

影響神經干細胞分化的因素很多，機制復雜。bFGF是目前應用最廣泛的刺激干細胞分裂的絲裂原信號，它一方面保持神經干細胞的未分化狀態(tài)，一方面在一定程度上影響其分化。Kilpatrick等［7］發(fā)現高濃度的bFGF可以刺激神經干細胞分化為神經元，但在血清存在時，神經元產生較少。bFGF對神經干細胞分化成星形膠質細胞的影響未見報道。

本研究表明大鼠脊髓來源的神經干細胞在體外能夠分化成4種形態(tài)類型的星形膠質細胞。傳統觀點認為星形膠質細胞分為2種：纖維型和原漿型星形膠質細胞。這種分類法過于簡單，星形膠質細胞不論在形態(tài)、受體的分布及胞質活性物的含量等方面都存在明顯的異質性。Miller等［8］在體外培養(yǎng)大鼠脊髓的星形膠質細胞中發(fā)現有胞體延長型、扁平多角型、星型、小圓餅型、大圓餅型和雙極型共6種形態(tài)類型的星形膠質細胞。本研究中神經干細胞分化成的星形膠質細胞分別對應于Miller等［8］研究中的胞體延長型、扁平多角型、星型和雙極型，沒有觀察到小圓餅型和大圓餅型兩種亞型。因此，脊髓來源的神經干細胞能夠分化成大多數脊髓中含有的星形膠質細胞類型。實驗中沒有觀察到圓餅型細胞，原因尚不清楚，可能是由于成體干細胞不具備分化成該種星形膠質細胞的能力，也可能圓餅型細胞是由其他細胞轉化而來，有待于進一步研究。

本研究還表明，神經干細胞分化過程中加入bFGF可以明顯促進雙極型星形膠質細胞的突起生長。雙極型星形膠質細胞的功能目前仍不清楚，有學者認為它與神經細胞遠距離通訊有關。其突起長度的變化對功能的影響有待進一步研究。已有研究指出，星形膠質細胞形態(tài)的改變可能具有重要的功能意義［9］。

不同類型的星形膠質細胞具有不同的功能［10，11］。Song等［12］的研究表明：來自成人海馬的星形膠質細胞可以指導未分化細胞轉變成神經元，即調節(jié)神經元的發(fā)生。國內學者發(fā)現扁平多角的星形膠質細胞比發(fā)出星狀突起的星形膠質細胞更有利于神經干細胞向神經元分化［13］。國外學者針對膠質細胞的異質性，不同形態(tài)的膠質細胞的不同功能進行了探索性的研究。目前還不清楚不同亞型的星形膠質細胞在中樞神經系統損傷后發(fā)揮何種作用［14］。

本研究首次報道脊髓來源的神經干細胞分化成星形膠質細胞亞型和bFGF對雙極型星形膠質細胞的突起生長影響的情況，開拓了星形膠質細胞異質性研究和神經干細胞定向分化研究的思路和方法。我們將在后續(xù)研究中進一步探索雙極型星形膠質細胞突起的功能，觀察神經干細胞移植到動物體內后分化成星形膠質細胞亞型的情況，這對于理解神經干細胞移植后的分化過程，改善神經干細胞移植治療脊髓損傷的效果具有重要意義。

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