間歇低氧促進大鼠動脈粥樣硬化機制的研究

佟浩，孫曉，張曼，王實

（1.中國醫科大學基礎醫學院組織工程學教研室，沈陽110001；2.沈陽醫學院奉天醫院循環內科，沈陽110024；3.沈陽醫學院奉天醫院呼吸內科，沈陽110024）

睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）以反復間歇低氧為特征，是多種全身性疾病的獨立危險因素之一，發病率約2%～4%［1］。OSA患者通常并存糖尿病、代謝綜合征［2］。動脈粥樣硬化（atherosclorosis，AS）是OSA并存肥胖、代謝綜合征等引起的最終結果，還是OSA的獨立作用是目前睡眠醫學的研究熱點。本研究擬通過觀察慢性間歇低氧及同步藥物干預狀態下大鼠平滑肌細胞屏氧酶1（paranoxonase-1，PON1）和 Rho激酶的表達，探討慢性間歇低氧狀態下發生AS的可能機制，闡明間歇低氧促進AS的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Wistar大鼠（購于中國醫科大學實驗動物中心）32只，體質量（334±7）g，以隨機數字法分為 4組：常氧組（A組），慢性間歇低氧組（B組），慢性間歇低氧+瑞舒伐他?。– 組，20 mg·kg-1·d-1，口服，每日1次），慢性間歇低氧+法舒地爾（D組，20mg·kg-1·d-1，腹腔注射，每日1次）。每日高膽固醇飲食［3］（20 g/只）固定食量喂養，隨意飲水，每晚6時起行正常運動量活動——游泳1 h（游泳水面面積為1.13 m2，水深為大鼠身長的2倍，水溫保持在34～36℃）［4］。并隨機設立正常對照組（E組），給予普通鼠糧喂養（20 g/只），隨意飲水，運動量相同，給予常氧。30 d后處死。本研究經沈陽醫學院奉天醫院倫理委員會批準。

通氣方案：B組：在預留進出氣孔的封閉箱體內，由進氣孔交替給予10%O2（氮氣平衡）和室內空氣（21%O2），90 s交替，出氣孔連接氣體檢測儀，分析箱內O2和CO2濃度，通過調節氮氣流量，使箱內氣體在10%O2和空氣之間交替循環［2］。A組在預留進出氣孔的封閉箱體內，持續吹入空氣。實驗每天早晨8時開始，8 h/d，基本在大鼠睡眠時進行。

1.2 方法

1.2.1 血脂檢測及主動脈內膜HE染色：藥物干預結束后，測大鼠體質量。1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后摘取眼球取血于EP管中，將一部分血標本置于4℃30 min，10000g離心10 min，取血清應用膽固醇氧化酶法測定總膽固醇（TC），甘油三酯磷酸氧化酶法測定甘油三酯（TG），磷鋁酸-鎂沉淀法檢測低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。另一部分血用于PON1活性檢測。截取主動脈弓，一部分置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，HE染色后光鏡觀察；另取一部分-70℃保存，用于RT-PCR和活性檢測。

1.2.2 RT-PCR法行血管平滑肌PON1和Rho激酶mRNA［5～7］檢測：采用異硫氰酸胍法提取血管平滑肌標本中的總RNA。取總RNA1μL，采用RNA PCR Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA。取逆轉錄產物2 μL進行PCR擴增反應。PON1：上游引物5′-GGATTCGAAGCACCTCTGATG-3′， 下 游 引 物5′-TGTTCGAGTGGCAGAAGCA-3′，擴增產物長度為222 bp；Rho激酶：上游引物5′-GAGCAACTATGATGTGCCTGAAAAAT-3’，下游引物5′-GATGTCGTTTGATTT CTTCTAC-3’，擴增產物長度為512 bp；β-actin：上游引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAA-3’，下游引物5’-AGCCATGCCAAATGTGTCAT-3’，擴增產物長度為387 bp。擴增條件：90℃預變性10 min；94℃變性80 s，55℃退火 90 s，72℃延伸 60 s，循環30次；72℃延伸10 min。取擴增產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠圖像掃描系統掃描。以βactin為內參，計算PON1、Rho激酶mRNA與βactinmRNA的灰度比值。

1.2.3 血清PON1活性測定［8］：取血清，以苯乙酸作為PON1的底物于270 nm進行測定。苯乙酸混合反應試劑由苯乙酸1.0 mmol/L、氯化鈣0.9 mmol/L、tris HCl20 mmol/L組成，pH8.0。在25℃下用270 nm分光光度儀測定的血清PON1活性（芳香基酯酶活性）由每分鐘水解苯乙酸的最大反應速率決定，其水解速度需減去無血清時的反應速度。270 nm的反應系數為1310 mmol/L，1單位PON1活性相當于每分鐘每毫升水解1 mmol苯乙酸的量。

1.2.4 血管平滑肌組織Rho GTPases與GTP結合活性檢測［9］：血管平滑肌組織研碎后，加入冰浴裂解液（0℃NP-40裂解液）中裂解，冰上放置30 min，勻漿，離心（4℃，12000g，15 min），留取上清液。按Lowry比色法測定樣品蛋白濃度。0.3 mL上清液加入0.1 mL SDS加樣緩沖液，沸水中煮沸5 min，經12%SDS-PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素（NC）膜，而后在緩沖液（25 mmol/L Tris，192 mmol/L甘氨酸）中復性并孵育過夜，換成結合緩沖液（50 mmol/L Tris pH7.5，0.3%Tween-20，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA），室溫孵育20min 后，加入［α-32P］GTP（20 mCi/mL）室溫孵育90 min，用結合緩沖液洗NC膜10 min3次，最后于-80℃2 d放射性自顯影，觀察定位于膜上的Rho GTPases與［32P］GTP的結合。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般情況

各組大鼠間體質量差異無統計學意義（P>0.05）。與 E 組對比，A、B、C、D 組大鼠 TC、TG 和 LDL-C 水平顯著升高，HDL-C降低，差異具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；A、B兩組間對比差異無統計學意義（P>0.05）；與B組對比，C組大鼠的TG和LDL-C水平顯著降低（P<0.05），TC水平有降低趨勢，HDL-C水平有升高趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05），D組血脂差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 主動脈內膜HE染色結果

肉眼觀察E組大鼠主動脈血管柔軟有彈性，色澤粉紅，內膜光滑，A、B組血管僵硬、管壁增厚，C、D組血管僵硬度則明顯改善。光鏡下觀察E組血管壁層次清楚，管腔內皮光滑、無明顯增生，平滑肌排列整齊、規則；A組血管壁結構紊亂，內膜增生，血管中膜不規則增生，平滑肌細胞排列紊亂，B組除上述表現加重外，還可見中膜基層壞死；C、D組主動脈內膜增生較A、B組明顯改善，血管結構較清晰，中膜平滑肌纖維稍顯紊亂，無中膜基層壞死，但比E組的病理改變重，C組、D組差異不明顯。見圖1。

2.3 大鼠血管平滑肌PON1和Rho激酶mRNA的表達及活性

與E組比較，A、B、D組大鼠PON1mRNA表達顯著下調（P<0.05或P<0.01），A、C 組大鼠 Rho激酶mRNA表達顯著增加（P<0.05或P<0.01）；與B組比較，C組PON1mRNA表達顯著上調（P<0.05或P<0.01），C、D兩組Rho激酶mRNA表達顯著下降（P<0.05或P<0.01），差異具有統計學意義，C、D兩組間差異無統計學意義（P>0.05），見表2，圖2、3。

2.4 大鼠血清PON1活性的表達

與E組對比，A、B、D組大鼠血清中PON1活性明顯降低（P<0.05或 P<0.01）；與 A、B、D 組對比，C組PON1活性明顯增高（P<0.05或P<0.01）。見表2。

2.5 大鼠血管平滑肌組織Rho GTPases與GTP的結合活性

與E組對比，A、B、C組大鼠Rho GTPases活性明顯增高（P<0.05或 P<0.01）；與 A、B 組對比，C、D組Rho GTPases活性顯著降低 （P<0.05或P<0.01），C、D兩組對比差異無統計學意義（P>0.05）。見表2，圖 4。

3 討論

間歇低氧致神經、內分泌變化使心血管疾病發病率和死亡率明顯高于一般人群［10～13］。OSA在睡眠狀態下是一種慢性可復性缺氧，類似于冠脈的缺血再灌注，可導致機體慢性炎癥的形成［14］。肥胖、脂代謝異常和代謝綜合癥是OSA的易患因素，兩者互相促進，是引起和加重OSA患者AS的主要原因，但對于OSA本身是否可以獨立于肥胖和血脂異常之外，通過應激和炎性反應促進AS的發生、發展及其機制尚未明確。

本研究結果顯示，與A組相比，B組在相同飲食及活動量狀態下，體質量、血脂無顯著差異，但是動脈硬化明顯，且PON1表達及活性降低，Rho激酶表達及活性增高，提示獨立于肥胖和血脂之外，間歇低氧可促進AS發生、發展，其機制可能與炎性因子PON1、Rho激酶相關。葉亮等［15］指出OSA可能與血脂水平紊亂無明顯關系，本研究結果與其相似。

當機體處于炎癥狀態時，體內HDL-C結構成分發生改變，使其抗AS作用喪失甚至逆轉。血清中的PON1由肝臟合成，幾乎全部存在于HDL顆粒中［5］。目前認為PON1作為HDL-C的抗氧化酶成分，其活性可能成為HDL-C抗AS保護作用的新的有效標志物［6］。本研究結果顯示，與B組相比，在體質量無明顯差異的情況下，給予瑞舒伐他汀干預后，C組除血脂及AS改善外，血管平滑肌PON1mRNA表達增加，血清PON1活性增高，提示在不受高膽固醇飲食、體質量影響的情況下，瑞舒伐他汀有可能通過降低血脂及PON1途徑保護HDL-C的抗氧化功能，對OSA模型起到抗AS作用，進一步證實OSA可經炎性作用對AS起作用。

Rho激酶廣泛存在于哺乳動物組織細胞中，為絲/蘇氨酸蛋白激酶，可與Rho-GTP相結合，Rho激酶拮抗劑不僅從受體水平阻滯Rho GTPases的活性，而且可明顯降低組織中Rho激酶基因表達水平，參與心血管病的調節［7］。本研究結果顯示，與B組比較，C組Rho激酶基因表達和Rho GTPases活性降低，而D組在血脂、體質量無差異狀態下，AS明顯改善且Rho激酶基因表達和Rho GTPases活性降低，提示在不受血脂、體質量影響的條件下，瑞舒伐他汀和法舒地爾可通過拮抗Rho激酶表達對OSA致AS起干預作用，這可能是OSA致AS發生、發展的另一原因。另外，C、D兩組除血脂存在明顯差異外，AS程度及拮抗Rho激酶和Rho GTPases活性作用差異不顯著，提示血脂對OSA致AS影響并不是至關重要的。

綜上所述，OSA除合并肥胖、脂代謝異常及代謝綜合征與AS密切相關外，它在不受血脂、體質量影響的情況下可能通過應激作用，激活慢性炎性反應，如PON1和Rho激酶表達異常，促進AS的發生和進展。

［1］美國心臟協會/美國心臟病學會基金會（ACC/AHA）.睡眠呼吸暫停與心血管疾病的科學聲明［S］.2008.

［2］馮學威.實驗性間斷低氧大鼠和阻塞性睡眠呼吸暫停患者下丘腦-垂體-腎上腺軸和生長激素軸的調節［D］.中國優秀博碩士學位論文全文數據庫（博士），2005.

［3］杜紀兵，叢洪良，楊萬松，等.阿托伐他汀在小鼠頸動脈粥樣硬化形成中的作用［J］.天津醫藥，2008，36（4）：285-287.

［4］趙杰修，田野，曹建民，等.不同運動方式對大鼠血紅蛋白濃度的影響-大鼠運動性貧血模型建立方法探討［J］.中國運動醫學雜志，2004，23（4）：436-440.

［5］DurringtonPN，MacknessB，MacknessMI.Paraoxonase and atherosclrosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21（4）：473-480.

［6］Tomás M，Latorre G，Sentí M，et al.The antioxidant function of highdensity lipoproteins：a new paradigm in atherosclerosis［J］.Rev Esp Cardiol，2004，57（6）：557-569.

［7］張曼，屈晨，曾定尹.Rho/Rho激酶在壓力負荷心力衰竭大鼠心肌組織的表達［J］.中華心血管病雜志，2005，33（1）：73-76.

［8］Rozenberg O，Rosenblat M，Coleman R，et al.Paraoxonase（pon1）deficiency is associated with increased macrophage oxidative stress：studiesinpon1knockoutmice［J］.FreeRadicBiolMed，2003，34（6）：774-784.

［9］張曼，佟浩，王文剛，等.法舒地爾對心力衰竭大鼠心室重塑干預及 Rho GTPases活性的作用［J］.中國新藥與臨床雜志，2007，26（9）：671-674.

［10］睡眠呼吸疾病學會.睡眠呼吸暫停人群高血壓患病率的多中心研究［J］.中華結核和呼吸雜志，2007，30（12）：894-897.

［11］Kimoff RJ，Sforza E，Champagne V，et al.Upper airway sensation in snoringandobstructivesleepapnea［J］.AmJRespairCritCareMed，2001，164（2）：250-255.

［12］張挪富，鐘南山.阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征與腦血管疾病的關系［J］.中華結核和呼吸雜志，2003，26（9）：513-515.

［13］陳光輝，王士雯，張文莉，等.睡眠呼吸暫停低通氣綜合征與心血管疾病相關性的臨床分析［J］.中華老年多器官疾病雜志，2005，4（4）：266-269.

［14］張熙.現代睡眠醫學［M］.北京：人民軍醫出版社，2007：305-311.

［15］葉亮，李敏，陳聆，等.阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合癥患者血脂及血液流變學的變化［J］.中華結核和呼吸雜志，2009，32（12）：926-930.