小鼠腎發(fā)育中集合管細胞的超微結(jié)構(gòu)變化及AQP-4的表達

李曉明，郭敏，于嵩

（1.遼寧醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，遼寧 錦州121001；2.遼寧中醫(yī)藥大學組胚教研室，沈陽110847）

腎臟集合管由兩種細胞構(gòu)成，主細胞和閏細胞，也分別叫做明細胞和暗細胞。其中閏細胞又分為A、B兩種類型。水通道蛋白（aquaporins，AQP）是介導不同類型細胞膜跨膜轉(zhuǎn)運水的通道蛋白［1］。AQP在腎臟的表達及發(fā)育性變化對于維持腎臟正常的尿濃縮功能至關重要，許多腎臟疾病如腎性尿崩癥、多囊腎、急慢性腎功能衰竭等的發(fā)生均與AQP的異常有關［2，3］。本實驗應用透射電鏡、免疫組織化學、Western blot技術及體視學方法觀察并檢測小鼠腎集合管發(fā)育過程中主細胞和閏細胞的形態(tài)學變化及AQP-4的表達規(guī)律，探討AQP-4與小鼠腎集合管細胞發(fā)育的相互作用關系。

1 材料與方法

1.1 動物培養(yǎng)和取材

昆明系小鼠雌雄（1∶1）同窩飼養(yǎng)。采用檢查陰道栓出現(xiàn)的方法確定雌鼠受孕時間。見雌鼠陰道栓出現(xiàn)計為胚齡0 d（E0 d）。對孕鼠飼養(yǎng)2周后，每日早8時、晚5時觀察生產(chǎn)情況，觀察到仔鼠出生的最早時間計為生后0 d（P0 d），分別取胚齡14，16，18 d的胎鼠和生后1，3，7，14，21，42 d 的仔鼠各10 只。將孕鼠用乙醚麻醉后剖腹取出胎鼠，胚齡14，16，18 d的胎鼠剖腹取腎。生后各齡仔鼠頸椎脫臼處死，于腹后壁取腎。其中5只胎鼠和仔鼠的左腎入2.5%戊二醛固定液固定行透射電鏡樣品制備，右腎入10%甲醛固定液固定行石蠟切片制備。另5只胎鼠和仔鼠腎臟入液氮冷凍，-80℃保存。

1.2 透射電鏡樣品的制備

組織塊用2.5%戊二醛固定液固定24 h后，取經(jīng)腎門橫斷的薄片，將髓質(zhì)切成1 mm3的小塊，入0.1 mol/L磷酸緩沖液中沖洗，1%鋨酸后固定，常規(guī)脫水，環(huán)氧樹脂定向包埋，做厚度1 μm的半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡下定位，再進行超薄切片，厚度50～70 nm，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，透射電鏡（JEOL1200EX）觀察。

1.3 免疫組化染色

石蠟切片厚5 μm，常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育8 min，枸櫞酸鹽微波修復10 min，BSA室溫孵育20 min，滴加兔多克隆抗體 AQP-4（1∶50，武漢博士德公司）濕盒中4℃過夜，二抗37℃溫箱30 min，SABC37℃溫箱30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作陰性對照。光學顯微鏡下觀察并攝片。

1.4 體視學測量

每個動物的腎組織系統(tǒng)隨機取5張切片，每張切片在油鏡下按“S”形選取視野，采用方格測試系統(tǒng)，交點計數(shù)法測算集合管細胞陽性反應物表達的面密度值，公式為：Sv=2Ix/Lc（Lc=ΣPc·a），式中Ix為陽性表達的細胞膜與測試方格的交點數(shù)，Pc為測試系統(tǒng)落在參照系（集合管）的點數(shù)，a為方格的兩點間距離，相當于實際長度的0.1 mm。

1.5 Western blot測定

取-80℃冷凍待用的腎組織，加入裂解液，剪碎、勻漿、離心，考馬斯亮藍法蛋白質(zhì)定量，樣品制備，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，ECL顯色。應用FluorchemⅤ2.0系統(tǒng)進行光密度測定，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin的平均吸光度的比值表示蛋白水平，并進行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學處理

應用SPSS16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 集合管細胞超微結(jié)構(gòu)觀察

小鼠胚齡18 d在髓質(zhì)和輸尿管芽壺腹部均可見發(fā)育早期的主細胞，胞體大而圓，胞質(zhì)染色淺淡，細胞核大而圓，細胞器少，線粒體較小而圓，基底部質(zhì)膜內(nèi)褶很少；生后7 d，細胞數(shù)量明顯增多，線粒體增多；生后21 d，細胞胞體顯著增大，基底部質(zhì)膜內(nèi)褶及胞質(zhì)內(nèi)線粒體均顯著增多，部分細胞游離面出現(xiàn)了短而鈍圓的微絨毛，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完善。A型閏細胞于胚齡18 d出現(xiàn)在髓質(zhì)集合管，細胞游離面可見微褶襞和微絨毛，胞質(zhì)染色深，近游離面胞質(zhì)區(qū)可見管泡狀結(jié)構(gòu)及線粒體；生后21 d，有大量微絨毛和線粒體；B型閏細胞于生后21 d才出現(xiàn)，細胞游離面平滑，微絨毛相對較少，胞質(zhì)染色較深，管泡狀膜結(jié)構(gòu)較多，側(cè)基底膜寬闊（圖1）。

2.2 AQP-4免疫組化染色結(jié)果

AQP-4表達在集合管細胞的基底膜和側(cè)膜，陽性反應物呈棕黃色。胚齡14 d，AQP-4出現(xiàn)微弱陽性反應產(chǎn)物，隨著胚齡的增加表達逐漸增多（圖2）。

2.3 體視學測量結(jié)果

AQP-4在集合管細胞側(cè)膜和基底膜的表達隨著腎臟發(fā)育成熟而表達逐漸增多，于生后1 d達到高峰，此后其表達量無明顯變化。小鼠腎不同發(fā)育階段AQP-4在集合管陽性表達的面密度值見圖3。

2.4 AQP-4免疫印跡結(jié)果

AQP-4和β-actin的分子量分別為34 kb和42 kb，條帶清晰。以β-actin的吸光度值作為內(nèi)參照，對各組條帶的吸光度值進行校正，進行半定量分析。AQP-4蛋白于胚齡14 d出現(xiàn)，顯色較淡，隨著胚齡增加表達逐漸增多，生后1 d達到高峰，顯色較深，此后變化不大（圖4）。

3 討論

哺乳動物的腎起源于輸尿管芽及其誘導的生后腎組織，輸尿管芽最終發(fā)育成集合管。集合管與尿液的濃縮及酸堿平衡調(diào)節(jié)密切相關［4］。AQP是一組介導不同類型細胞膜跨膜轉(zhuǎn)運水的通道蛋白，迄今為止在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13種AQP家族成員［5］。其中AQP-4在全身分布較為廣泛，主要在中樞神經(jīng)組織，其次在腎臟也有一定量的分布，對腎臟水平衡的調(diào)節(jié)具有一定的作用［6］。本實驗應用透射電鏡、免疫組織化學、Western blot技術及體視學方法觀察并檢測小鼠腎發(fā)育過程中集合管細胞的形態(tài)學變化及AQP-4的表達規(guī)律，探討AQP-4與小鼠腎集合管細胞發(fā)育的相互作用關系。

研究表明主細胞具重吸收Na+、分泌K+的功能，這種功能是通過游離面的Na+通道和側(cè)基底膜上的Na+泵來完成的。閏細胞是腎臟調(diào)節(jié)酸堿平衡的主要細胞［7］。通過對主細胞的電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)胚胎18 d時主細胞出現(xiàn)在輸尿管芽，發(fā)育早期的主細胞中細胞器少，線粒體小而圓，無管泡狀結(jié)構(gòu)，基底部的質(zhì)膜內(nèi)褶很少。生后21 d細胞明顯增大，囊泡數(shù)量增多，線粒體和基底部質(zhì)膜內(nèi)褶也顯著增多，部分細胞出現(xiàn)了短而鈍圓的突起或微絨毛，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本完善，說明主細胞在生后3周左右完成形態(tài)學上的分化。閏細胞分為A、B2種類型。胚胎18 d，A型閏細胞出現(xiàn)在輸尿管芽，具有大量的微絨毛和微皺襞，近游離面胞質(zhì)內(nèi)有大量管泡狀膜結(jié)構(gòu)。具有典型B型閏細胞特點的細胞是在生后21 d出現(xiàn)的，說明在生后早期，主要由A型閏細胞發(fā)揮腎臟調(diào)節(jié)酸堿平衡的功能。Schwartz等［8］對家兔的研究也認為生后1周，A型閏細胞對酸堿平衡的作用比B型閏細胞大。雖然A型閏細胞在胚胎時期就已出現(xiàn)，但其形態(tài)結(jié)構(gòu)的完善是在生后進行的。由此可見，盡管在胚胎后期和出生時A型閏細胞已經(jīng)開始擔負調(diào)節(jié)酸堿平衡的功能，但出生時集合管的兩種細胞都未發(fā)育完善，因此在生后1個月內(nèi)腎臟各項功能就不完善，代償能力差。

以往的研究認為在集合管水平衡調(diào)節(jié)中AQP-2起了限制性的作用，并且證明AQP-2在集合管出現(xiàn)之前是不存在的［9］。胚齡14 d的小鼠腎臟還處于輸尿管芽時期，沒有形成真正的集合管。本實驗結(jié)果顯示，在胚齡14 d即可見AQP-4表達，因此推測AQP-4對胚胎時期腎臟水平衡的調(diào)節(jié)起到了比較重要的作用。此后隨著腎臟的進一步發(fā)育，集合管的出現(xiàn)，AQP-4則表達在集合管細胞的側(cè)基底細胞膜，其表達量在出生時達到一定的高度，隨后在腎臟發(fā)育過程中沒有明顯的變化。而尿液濃縮能力的形成主要在生后7～21 d這段時間，且AQP-4缺失的試驗只表現(xiàn)最大尿濃縮能力的輕微降低［10］。因此我們推測AQP-4對生前小鼠腎臟水平衡的調(diào)節(jié)起了重要的作用，而對生后腎臟水平衡的調(diào)節(jié)可能只是起輔助性作用。

［1］Hachez C，Chaumont F.Aquaporins：a family of highly regulated multifunctional channels［J］.Adv Exp Med Biol，2010，679：1-17.

［2］Verkman AS.Dissecting the roles of aquaporins in renal pathophysi－ology using transgenic mice［J］.Semin Nephrol，2008，28（3）：217-226.

［3］Wilting I，Baumgarten R，Movig KL，et al.Urine osmolality，cyclic AMP anaquaporin-2 in urine of patients under lithium treatment in response to water loading followed by vasopressin administration［J］.Eur J Pharmacol，2007，566（1-3）：50-57.

［4］Hafner P，Grimaldi R，Capuano P，et al.Pendrin in the mouse kidney is primarily regulated by Cl-excretion but also by systemic metabolic acidosis［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2008，295（6）：C1658-1667.

［5］Parreira KS，Debaix H，Cnops Y，et al.Expression patterns of the aquaporin gene family during renal development：influence of genetic variability［J］.Pflugers Arch，2009，458（4）：745-759.

［6］楊寶學，趙雪儉.水通道蛋白研究進展［J］.中國病理生理雜志，2005，21（8）：1619-1622.

［7］ Wagner CA，Devuyst O，Bourgeois S，et al.Regulated acid-base transportinthecollectingduct［J］.Pflugers Arch，2009，458（1）：137-156.

［8］Schwartz GJ，Olson J，Kittelberber AM，et al.Postanal development of carbonic anhydrase Ⅳ expression in rabbit kidney［J］.Am J Physiol，1999，276（4Pt2）：F510-520.

［9］Rivarola V，F(xiàn)lamenco P，Melamud L，et al.Adaptation to alkalosis induces cell cycle delay and apoptosis in cortical collecting duct cells：role of Aquaporin-2［J］.J Cell Physiol，2010，224（2）：405-413.

［10］Wang JF，Wang ZY，Wu N，et al.Effects of aquaporin4 deficiency on opioid receptors characteristics in naive and chronic morphinetreated mice［J］.Neurosci Lett，2009，457（3）：111-114.