RhoA/ROCK信號系統對血管外膜炎癥介導的大鼠頸動脈平滑肌細胞增殖和表型變化的影響

程木秋，霍海洋，張海山

（中國醫科大學附屬第一醫院心內科，沈陽110001）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是嚴重危害人類健康的常見心血管疾病之一。血管內皮細胞的功能障礙和損傷被認為是AS發病的始動因素。但隨著研究的深入，血管外膜作為AS發生、發展的重要因素日益受到重視。研究顯示，AS引起的血管重塑與外膜有關［1］。伴隨著AS的發生、發展，血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）的形態結構與功能也發生著變化，而血管外膜同樣參與對 VSMC 的調節［2］。

研究發現，RhoA/ROCK（RhoA-binding kinase）信號系統在影響VSMC增殖和表型變化方面起重要作用。本研究采用硅膠管包裹大鼠頸動脈的方法建立血管外膜慢性炎性損傷介導的AS模型，觀察了VSMC形態結構變化，并通過檢測RhoA/ROCK信號系統的功能狀態，探討了在該模型條件下RhoA/ROCK信號系統對VSMC的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：12周齡雄性Wistar大鼠20只，體質量270～320 g。由中國醫科大學實驗動物部提供。

1.1.2 主要試劑及材料：RNAsimple Total RNA Kit、TIANScript RT Kit（TIANGEN 公司，中國）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司，江蘇）；Mouse anti SM α-actin、Rabbit anti ROCK2 抗體（Abcam 公司，美國）；Rabbit anti Myocardin抗體（ABBIOTEC公司，美國）；硅膠醫用管（濟南晨生醫用硅橡膠制品有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組：大鼠適應性喂飼1周后，隨機分為：（1）模型組（n=20）：常規麻醉后，消毒頸部正中皮膚，解剖分離出左、右兩側頸總動脈，包裹硅膠管 7 d構建模型；（2）對照組（n=20）：解剖分離出雙側頸總動脈后不包裹硅膠管，其余手術過程同模型組。自由進食飲水，7 d后處死，模型組截取包裹硅膠管的血管段，對照組留取相應血管段。

1.2.2 病理學檢測：取左頸動脈包裹血管段1/2及對照組左頸動脈相應血管段，常規石蠟包埋，3～4 μm切片，HE染色。光鏡觀察動脈外膜炎性浸潤程度及中膜、內膜改變。

1.2.3 RT-PCR 測定血管組織 SM α-actin、ROCK2水平：取左頸動脈包裹血管段1/2及對照組左頸動脈相應血管段，利用試劑盒提取樣本總RNA。利用TIANScript RT Kit對所得的RNA樣本進行反轉錄以得到對應的cDNA。行PCR擴增反應，以β-actin為內參照。引物序列：α-actinF5′CTCATCCACGAAACCACCTAT3′，α-actinR5′CGCCGATCCAGACAGAATA3′，ROCK2F5′CGTTATCGGGCTTCACATCTC3′，ROCK2R5′AACAGTCCGTGGGTGGTTCA3′。擴增產物經1.5%和0.8%的凝膠的混合瓊脂糖凝膠電泳，照相并分析數據。

1.2.4 Western blot檢測血管組織 SM α-actin 與ROCK2蛋白表達：取右頸動脈整根包裹血管段及左頸動脈相應血管段，置于-80℃冰箱凍存。提取血管組織蛋白后，BCA法進行蛋白定量，上樣，行SDSPAGE電泳。轉膜，封閉后加入小鼠抗大鼠SM αactin抗體（1︰800）及兔抗大鼠 ROCK2抗體（1︰1000），4℃過夜；加入1︰10000 HRP標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TTBS緩沖液沖洗5 min，6次。ECL顯色，曝光，顯影后掃描其光密度值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 硅膠管包裹1周后大鼠頸動脈血管形態學變化（圖1）

2組大鼠頸動脈經HE染色后光學顯微鏡下觀察并比較。與對照組大鼠頸動脈（圖1A）相比，硅膠管包裹大鼠頸動脈1周后，模型組大鼠頸動脈（圖1B）血管外膜增厚，炎性細胞浸潤；中膜平滑肌明顯增生增厚，VSMC數量增多、排列紊亂；內膜無明顯差別。

2.2 大鼠頸動脈中SM-αactin的表達

用RT-PCR檢測2組大鼠頸動脈 SM-αactin mRNA表達，結果見圖2。模型組SM-αactinmRNA表達（與β-actin光密度比值為0.92±0.024）顯著高于對照組（0.76±0.077），2組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

用Western blot檢測2組大鼠頸動脈SM-αactin的蛋白表達，結果見圖3。模型組SM-αactin蛋白的表達（與β-actin表達水平光密度比值為0.44±0.034）高于對照組（0.31±0.065），2組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 大鼠頸動脈中ROCK2的表達

用RT-PCR方法檢測2組大鼠頸動脈ROCK2 mRNA表達水平，結果見圖4。模型組ROCK2mRNA表達水平（與β-actin表達水平光密度比值為0.64±0.034）與對照組（0.61±0.065）相比，差異無統計學意義。

用Western blot檢測2組大鼠頸動脈ROCK2蛋白的表達，結果見圖5。模型組ROCK2蛋白的表達水平（與β-actin表達水平光密度比值為1.17±0.025）明顯高于對照組（0.38±0.055），2組比較差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

AS是一種慢性炎性疾病，傳統觀念認為動脈內皮功能障礙/損傷是AS的始動因素，并影響病變全過程。隨著研究的深入，血管外膜在AS發病機制中的作用日益受到重視，它不但影響正常血管的結構功能，還與AS的發生、發展密切相關。采用硅膠管包裹實驗動物頸動脈血管的方法誘導血管外膜炎性損傷建立AS動物模型，已廣泛應用于研究AS的發病機制中［3］。本研究采用硅膠管套管包裹大鼠頸動脈1周的方法，光鏡下觀察到模型組大鼠血管形態結構變化與既往研究結果一致［4］，表現為動脈外膜增厚，炎性細胞浸潤，中膜VSMC增生，排列紊亂，未見新生內膜。本研究結果還發現，頸動脈組織中VSMC收縮表型的重要標志物SM α-actinmRNA和蛋白表達水平較對照組均增高，提示模型組大鼠頸動脈VSMC大量增生的同時，其分化水平以收縮表型為主。分析原因可能是VSMC具有動態分化增殖功能，在外界及生化與環境信號刺激下，表現為收縮表型和合成表型的組合和相互轉變［5～7］。因此，該模型中動脈VSMC在血管外膜慢性炎性損傷的刺激下發生了結構功能變化，具體表現為VSMC的大量增殖和收縮表型的表達。VSMC的這種表型可塑性和易變性在血管系統對損傷的應答反應和血管疾病（如AS）中起重要作用。

研究證實，RhoA/ROCK信號系統在VSMC增殖和收縮表型表達等心血管系統的調控方面起重要作用［8～10］。Rho為Ras超家族中的一個亞群，包括RhoA、RhoB、RhoC等亞型，具有信號轉導和分子開關功能［11］。Rho激酶/ROCK2是RhoA的下游效應器之一［12］，為絲/蘇氨酸蛋白激酶，作用十分廣泛。為探討RhoA/ROCK信號系統是否參與外膜炎性刺激下的VSMC結構和功能的調控，本研究于硅膠管包裹大鼠頸動脈7 d后測定了包裹血管段ROCK2的表達。結果發現，模型組大鼠頸動脈VSMC中ROCK2mRNA水平與對照組無差異，而蛋白表達水平較對照組均明顯增高，提示外膜炎癥激活了RhoA/ROCK信號系統，進而促進VSMC的增殖和收縮表型的表達。RhoA/ROCK信號系統調節VSMC的機制尚不清楚，有研究發現，RhoA/ROCK信號系統下調細胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑P27kip1，進而促進了VSMC的增生［13］；而該系統調控VSMC收縮表型的表達則可能是通過上調心肌素（myocardin）實現的［14，15］。myocardin 是平滑肌細胞發育和分化所必需的轉錄輔助因子，在平滑肌細胞過度表達后，可明顯激活SM22α、SM-αactin等收縮表型標志物的表達［16］。

綜上所述，本研究通過在體應用套管法誘發了血管動脈外膜慢性損傷，進一步揭示了血管外膜通過調控炎性反應而對VSMC形態結構和功能產生重要影響。其分子機制有可能是外膜炎性損傷激活了RhoA/ROCK信號系統，進而使VSMC大量增殖，收縮表型表達。

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