曲妥珠單抗與順鉑序貫聯(lián)合應(yīng)用對乳腺癌細胞抑制作用的研究

吳志勇，孫勝杰，焦順昌（解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科， 北京 100853）

HER-2（human epidermal growth factor receptors-2）基因的過度表達是乳腺癌的重要預(yù)后不良因素。曲妥珠單抗（赫賽汀，trastuzumab）是以HER-2/neu蛋白為靶點設(shè)計的人源化單克隆抗體。大量研究表明，曲妥珠單抗可明顯提高化療對HER-2/neu過度表達乳腺癌的療效，并可廣泛應(yīng)用于治療的各個階段[1]。但是在聯(lián)合治療方案中，曲妥珠單抗的使用最佳時機仍有待明確，因此，我們設(shè)計了關(guān)于曲妥珠單抗聯(lián)合化療序貫方式研究的系列實驗，已報道的曲妥珠單抗與多西他賽、吉西他濱的序貫聯(lián)合應(yīng)用的結(jié)果，與臨床應(yīng)用情況基本吻合[2-4]。本文旨在尋找曲妥珠單抗與順鉑聯(lián)合應(yīng)用的最佳序貫方式，并初步探討其機制，從而為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和試劑 MI/1640培養(yǎng)液（美國GIBCO公司）；胎牛血清（北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所）；MTT（美國AMRESCO公司）；順鉑（齊魯制藥）；曲妥珠單抗（上海羅氏制藥）。

1.1.2 主要設(shè)備 二氧化碳孵箱（美國Baxter）；96孔板（美國COSTOR3599）；酶標(biāo)儀（上海雷勃分析儀器有限公司，型號：Multiskan MK3353）；YKH2 Ⅱ型液體快速混合器（江西醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

人乳腺癌細胞珠MDA-MB453其Her-2/neu基因擴增為陽性，由解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科提供，用細胞計數(shù)板計數(shù)活細胞數(shù)。

1.2.1 MTT 法測定藥物作用抑制率 將2.0×104個細胞接種于96 孔板（200 μL/孔），培養(yǎng)24 h；將藥物按照不同濃度加入，共培養(yǎng)60 h；加入5% MTT 20 μL/孔，4 h后加入DMSO 200 μL/孔，振蕩；用酶標(biāo)儀（波長492 nm） 測定OD 值，最后結(jié)果取均值，以未處理組作為對照組，按下列公式計算各組的抑制率:抑制率（%） = 1– （實驗組OD492/ 對照組OD492）×100 %。

1.2.2 MTT法測定順鉑與曲妥珠單抗以不同序貫方式聯(lián)合應(yīng)用的抑制率 分別設(shè)立DDP前24 h應(yīng)用HER組、DDP前18 h應(yīng)用HER組、DDP前12 h應(yīng)用HER組、DDP前6 h應(yīng)用HER組、DDP+HER同時作用組、DDP后6 h應(yīng)用HER組、DDP后12 h應(yīng)用HER組、DDP后18 h應(yīng)用HER組、DDP后24 h應(yīng)用HER組序貫結(jié)合方式。將順鉑與曲妥珠單抗加入孔中。順鉑加入后培養(yǎng)60 h，MTT法測定各組的OD值，重復(fù)操作3次，取平均值，計算出實驗組抑制率。

利用以下金氏公式計算參數(shù)Q判斷兩藥的合并用藥效應(yīng)：

其中，Ea代表HER的抑制率，Eb代表DDP的抑制率，E（a+b）為兩藥聯(lián)合應(yīng)用的抑制率，即實測合并效應(yīng)，分母 Ea+ Eb– Ea*Eb為期望合并效應(yīng)，Q 為兩者相比。Q 值在 0.85 ～ 1.15 時，合并效應(yīng)為相加作用，Q值＞ 1.15為協(xié)同作用，Q 值＜ 0.85 為拮抗作用[5]。

流式細胞儀分析DDP與HER以不同序貫方式聯(lián)合對MDA-MB453細胞細胞周期的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，單因素方差分析比較各組，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 法測定藥物作用于MDA-MB453 細胞抑制率

通過計算得出DDP 30%抑制率濃度約為29.17 μg·mL-1。HER 15%抑制率約為7.19 μg·mL-1。

2.2 MTT 法測定各實驗組抑制率及Q值

結(jié)果見表1。結(jié)果表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用時效果均好于單藥DDP組的抑制率（30.98%，P ＜ 0.01）；其中兩藥同時應(yīng)用組及加入DDP后應(yīng)用HER組聯(lián)合抑制率明顯高于在DDP前應(yīng)用HER組，Q值提示各組均為相加作用，其中以兩藥同時使用時相加作用效果最好（Q = 1.106）。

表1 不同序貫方式順鉑與曲妥珠單抗聯(lián)合對乳腺癌細胞的抑制率. n = 9, ±sTab 1 Inhibition ratio of combined treatment of HER and DDP in different sequences to breast cancer cells. n = 9, ±s

表1 不同序貫方式順鉑與曲妥珠單抗聯(lián)合對乳腺癌細胞的抑制率. n = 9, ±sTab 1 Inhibition ratio of combined treatment of HER and DDP in different sequences to breast cancer cells. n = 9, ±s

注：聯(lián)合作用組抑制率與單藥DDP抑制率間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義, *P ＜ 0.01；兩藥同時應(yīng)用組Q值與其他組Q值間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，**P ＜ 0.01Note：the difference of inhibition ratio between HER+DDP and DDP was statistically significant, *P ＜ 0.01; Q-value difference between simultaneously combined group and other groups was statistically significant, **P ＜ 0.01

組別 HER抑制率/% HER + DDP抑制率/% Q值單藥DDP – 30.98±1.537 –加入DDP前24 h應(yīng)用HER 15.83±0.095 36.57±1.141* 0.872±0.012加入DDP前18 h應(yīng)用HER 17.58±0.291 39.71±1.192* 0.921±0.021加入DDP前12 h應(yīng)用HER 16.44±0.863 39.39±1.204* 0.930±0.062加入DDP前 6 h應(yīng)用HER 14.03±0.778 41.42±3.196* 1.018±0.055 DDP + HER同時應(yīng)用 20.46±1.298 49.88±1.531* 1.106±0.071**加入DDP后 6 h應(yīng)用HER 28.23±1.462 47.03±0.988* 0.932±0.060加入DDP后12 h應(yīng)用HER 26.61±1.353 48.04±1.386* 0.973±0.047加入DDP后18 h應(yīng)用HER 28.23±2.904 49.91±1.798* 0.988±0.103加入DDP后24 h應(yīng)用HER 28.71±2.481 50.80±1.675* 1.000±0.094

2.3 流式細胞儀分析順鉑與曲妥珠單抗以不同序貫方式聯(lián)合應(yīng)用對細胞周期的影響

結(jié)果見表2。結(jié)果表明，與單藥DDP化療組相比，DDP前應(yīng)用HER組G0/G1、S期細胞所占比例減少，G2/M期細胞增多，而其他組則未見明顯變化，提示此組中兩藥的相加作用較弱與細胞周期的影響有關(guān)。

3 討論

實驗結(jié)果顯示：曲妥珠單抗與順鉑聯(lián)合應(yīng)用抑制作用強于單藥順鉑，其機制在于：HER-2過度表達可降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，聯(lián)合使用曲妥珠單抗可引起HER-2蛋白的內(nèi)化，而減少表達，從而提高腫瘤細胞化療敏感性，而取得較好的抑制率[6-7]。此外，順鉑作用于細胞DNA引起損傷的啟動自身保護機制─非常規(guī)DNA合成進行DNA修復(fù)，Pietras RJ等[8]證明順鉑聯(lián)合使用曲妥珠單抗可明顯減少順鉑引起的非常規(guī)DNA合成，從而取得較好的治療效果。

表2 乳腺癌細胞經(jīng)曲妥珠單抗與順鉑處理后各細胞周期的變化.%，n = 3，±sTab 2 Changes of cell cycle of cancer cell with treatment of HER and DDP.%, n = 3, ±s

表2 乳腺癌細胞經(jīng)曲妥珠單抗與順鉑處理后各細胞周期的變化.%，n = 3，±sTab 2 Changes of cell cycle of cancer cell with treatment of HER and DDP.%, n = 3, ±s

注：聯(lián)合作用組細胞周期與單藥DDP進行單因素方差分析,*P ＜ 0.01Note: one-factor analysis of variance of cell cycle between combined treatment group and DDP group, *P ＜ 0.01

組別 G0/G1 S G2/M對照組 56.27±0.87 30.69±1.43 13.04±0.65單藥DDP 51.85±2.52 26.09±2.11 22.05±0.72單藥HER 65.32±2.32 24.11±1.73 10.57±2.15加入DDP前12 h應(yīng)用HER 30.94±2.01* 21.64±1.34* 47.42±3.38*DDP+HER同時應(yīng)用 49.60±1.37 24.79±1.93 25.61±2.82加入DDP后6 h應(yīng)用HER 53.89±2.04 24.61±1.45 21.50±0.93

在兩藥不同序貫方式聯(lián)合應(yīng)用的對比中發(fā)現(xiàn)，順鉑前應(yīng)用曲妥珠單抗效果較差。可能因為順鉑主要針對增殖活躍的細胞，而先使用曲妥珠單抗會使腫瘤細胞停止在G0/G1期而降低了腫瘤細胞的增殖活性，所以也在一定程度上降低了對細胞毒藥物的敏感性。細胞周期結(jié)果顯示：與單藥順鉑比較，先應(yīng)用曲妥珠單抗后應(yīng)用順鉑組出現(xiàn)了明顯的S、G2/M期阻滯，但對腫瘤細胞的抑制作用卻沒有明顯增高。可能是因為應(yīng)用曲妥珠單抗后激活了一些通路增加S、G2/M期細胞周期檢測點而增強了細胞DNA修復(fù)[9]，降低了兩藥聯(lián)合的抑制作用。

本實驗再次證實了曲妥珠單抗與順鉑對于腫瘤細胞的生長抑制作用及對細胞周期的影響。并得出了兩藥不同序貫方式聯(lián)合使用時，均表現(xiàn)為相加作用，其中同時應(yīng)用時效果最好，并利用流式細胞技術(shù)初步證明這種差異同細胞周期的變化有一定的關(guān)系。本次實驗為進一步的臨床應(yīng)用及研究提供實驗依據(jù)，但是不同的個體、細胞系及亞群是否具有相同規(guī)律，是否還涉及到其他機制，還有待進一步的基礎(chǔ)及臨床研究。