外源性腦源性神經營養因子對Alzheimer大鼠行為學的影響及其作用機制

徐愛華，王維，商秀麗

（中國醫科大學附屬第一醫院1.康復醫學科；2.神經內科，沈陽110001）

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一種以進行性認知功能減退為特點的神經系統變性疾病。記憶障礙，尤其是近記憶障礙，是AD典型的首發征象，隨后出現遠記憶受損、時間及空間定向障礙，晚期多伴有人格改變，嚴重影響老年人的生活質量。在所有與年齡相關的癡呆中，AD約占50%［1］。隨著社會老齡化的發展，估計到2050年我國65歲及以上老人約占總人口的35%，80歲及以上老人約占22%，AD患者預期可達2500萬，將成為影響家庭和社會發展的一個重要制約因素，因此必須對其進行積極防治。腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是腦內廣泛存在的一種神經營養因子。海馬CA3區是與學習和記憶密切相關的腦功能區，也是BDNF及其受體TrkB在腦內表達最集中的部位［2］。研究發現，AD患者腦內BDNF mRNA及蛋白表達較正常人腦明顯降低［3］，同時相應腦區突觸素的表達也明顯降低，說明二者之間可能存在著某種聯系，共同在AD發病中起作用。因此，我們通過對大鼠海馬CA3區立體定位注射岡田酸（okadaic acid，OA）建立模擬AD的大鼠模型，再用外源性BDNF對其作用，觀察外源性BDNF對腦內突觸素表達的影響以及對大鼠行為學的作用，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康成年雄性Wistar大鼠60只，體質量200～250 g，購自沈陽醫學院實驗動物中心。飼養溫度（20±2）℃，濕度70%，自然通風，自然光照，大鼠可自由接觸食水。

1.1.2 實驗試劑：OA（美國Upstate公司），BDNF（美國 Chemicon公司），突觸素抗體、K252a、LY294002、pThr231抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組：60只大鼠隨機平均分為正常對照組、假手術組、OA組、BDNF組、K252a組和LY294002組。

1.2.2 動物模型制作：大鼠用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔內注射麻醉，俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，沿顱頂正中線切開皮膚，暴露頭骨，按照大鼠腦立體定位圖譜定位：AP-3.8 mm，ML±3.8 mm，DV 4.0 mm，即為海馬CA3區注射點。假手術組大鼠每側海馬注射2 μL生理鹽水；OA組每側海馬注射2μL OA（0.2 μmol/L）；BDNF 組每側注射2μL OA+2 μL BDNF（50 ng/mL）；K252a 組每側注射2μL OA+2 μL BDNF+2 μL K252a （0.2 μmol/L）；LY294002 組每側注射2μL OA+2 μL BDNF+2 μL LY294002（0.2 μmol/L）。

1.2.3 水迷宮實驗

1.2.3.1 定位航行試驗 歷時4 d，每天上、下午各2次，將大鼠面向水迷宮池壁分別從4個入水點放入水中，記錄大鼠找到平臺所需要的時間，即逃避潛伏期。如大鼠在2 min內找不到平臺，則由試驗者將其引向平臺，其潛伏期為120 s。每次訓練間隔為60 s。

1.2.3.2 空間探索試驗 定位航行試驗結束后撤除平臺，然后將鼠任選一個點放入水中，測其2 min內跨越原平臺所在位置的次數及游泳軌跡。

1.2.4 標本采集：用于免疫組化檢測的動物用10%水合氯醛300 mg/kg經腹腔注射進行麻醉，然后開胸暴露心臟，先用生理鹽水經左室心尖插管快速灌注，再用4%多聚甲醛溶液（pH 7.2～7.4）持續灌注約300 mL，至大鼠四肢變硬后斷頭取腦，并于4%多聚甲醛中后固定48 h。用于Western blot檢測的動物，用水合氯醛深度麻醉后直接斷頭取腦，于冰盒上快速分離雙側海馬組織，放入1.5 mL Eppendorf管中，立即-80℃凍存。

1.2.5 Western blot：將凍存的組織融化。4℃裂解細胞，離心15 min，取上清。應用酚試劑法測定樣本中蛋白濃度。將電泳后的硝酸纖維素膜在轉印液中浸泡數分鐘后，轉印2 h。用含10%脫脂奶粉的封閉液封閉，4℃過夜。將封閉過夜的膜取出，加入p38（1∶1000）及 pThr231（1∶1000），室溫 4 h。將一抗孵育后的膜用TTBS洗5 min，2次，然后加入HRP標記的二抗（1∶2000），室溫2 h。二抗洗膜后，在暗室將熒光劑A液B液等量混勻后，立即加到膜上，反應1 min，將膜固定到曝光盒中，曝光1～5 min，依次顯影定影，比照曝光板上的膜記錄下marker和各條帶的位置。將蛋白印記顯影圖掃描，利用圖像分析軟件Scion Image對蛋白帶進行光密度分析。以β-actin作為內對照，將每一個蛋白帶的光密度值與相應內對照β-actin蛋白帶的比值作為所測蛋白的半定量指標。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 定向航行試驗

OA組及K252a組大鼠逃避潛伏期較正常組、假手術組、LY294002組及BDNF組明顯延長（P<0.01）；BDNF及LY294002組大鼠逃避潛伏期較正常組及假手術組也明顯延長（P<0.01）。見表1，圖1。

2.2 空間探索試驗

OA組及K252a組大鼠跨越平臺次數較正常對照組、假手術組、LY294002組及BDNF組明顯減少（P<0.01）；BDNF 組、LY294002組、正常對照組及假手術組比較，大鼠跨越平臺次數的差異無統計學意義（P>0.05）。見表1，圖2。

2.3 突觸素表達

正常對照組、BDNF組及LY294002組突觸素表達較OA組和K252a組增高（P<0.01），但正常對照組、BDNF組及LY294002組3組之間無統計學差異（P>0.05）。見圖3。

2.4 pThr231表達

OA組、LY294002組和K252a組pThr231表達較正常對照組及BDNF組明顯增多（P<0.01），但OA組、LY294002組及K252a3組3組比較無統計學差異（P>0.05）；BDNF組與正常對照組比較無統計學差異（P>0.05）。見圖4。

3 討論

突觸作為神經系統的特征性組織結構之一，是神經元之間相互作用的基本結構單位，是記憶形成的結構基礎。研究表明，突觸丟失是AD早期腦內一個重要的病理學特征［4］。突觸素是突觸終末特異性標記物，構成突觸囊泡特異性膜通道，參與囊泡的轉運與排放。突觸素密度與AD癡呆嚴重程度呈負相關［5］。我們在實驗中用OA對大鼠海馬CA3區進行立體定位注射，引起了大鼠顯著的空間記憶障礙，海馬突觸素蛋白及其mRNA表達明顯減少，tau蛋白Thr231位點過磷酸化。我們認為大鼠空間記憶障礙主要是由突觸結構及功能異常引起的，而tau蛋白的過磷酸化及神經營養因子的缺乏是引起突觸結構功能異常的主要原因。一方面，OA可直接導致tau過磷酸化；另一方面，BDNF及其受體的缺乏可引起PI-3K/AKT通路的失活，GSK-3β表達上調，增加tau蛋白的過磷酸化［6］。過磷酸化的tau蛋白可引起微管聚合、組裝、穩定性及功能異常，從而可導致突觸形成、生長、囊泡轉運等多方面障礙，使得突觸素表達減少。突觸素表達的減少意味著突觸數量的減少、突觸囊泡轉運能力的下降、突觸傳遞功能的減弱，由此可引起神經系統信息傳遞、加工和儲存障礙，導致學習記憶功能減退。

許多研究證明，BDNF通過對突觸生長、突觸可塑性及突觸傳遞的調節作用，在認知、學習和記憶形成中起重要作用［7］。BDNF在突觸可塑性的突觸前和突觸后機制中都是必需的，并且對記憶形成所必需的長時程增強的形成及保留［8］都是必需的。在細胞水平，BDNF被證明可增加突觸前神經遞質的釋放，調節現有的突觸運輸，并能增加突觸形成［9］；在分子水平，BDNF增加β-連環蛋白酪氨酸殘基的磷酸化，減少鈣黏蛋白-β-連環蛋白黏著復合物的解離［10］，促進細胞內環境的穩定。本研究應用外源性BDNF后，tau蛋白Thr231位點過磷酸化減少，海馬突觸素蛋白及其mRNA表達明顯升高，大鼠空間認知明顯改善。說明外源性BDNF確實可通過減少tau蛋白磷酸化、增加突觸形成、改善突觸結構和功能等多重途徑在記憶形成和保留過程中起著重要作用。

我們將TrkB受體抑制劑K252a與BDNF同時海馬內注射，BDNF的所有作用都被減弱，說明BDNF的生物學效應是以其受體TrkB為基礎的。BDNF與TrkB受體結合后將其激活，后者又可通過自動磷酸化引起MAPK、PI-3K等通路的激活［11］。研究證明，TrkB在調節海馬齒狀回神經元突觸結構中起著重要作用，特異敲除TrkB的小鼠突觸前及突觸后結構都發生了改變，共同影響皮質對齒狀回細胞的聯合輸入，并對CA3區的錐體細胞產生負反饋抑制［12］。研究中我們發現，PI-3K抑制劑LY294002存在時BDNF使tau蛋白去磷酸化作用減弱，但BDNF提高突觸素表達及其對大鼠行為學的改善并沒受影響，說明這一作用是不依賴于或不僅依賴于PI-3K/AKT通路的。

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