牙乳頭細胞促進大鼠牙髓干細胞中Wnt信號分子的表達

張忠提，張雪，李瑞武

（中國醫科大學1.口腔醫學院干診科；2.口腔醫學院中心實驗室；3.遼寧省口腔醫學研究所；4.口腔醫學院口腔頜面外科，沈陽110002）

牙髓干細胞（dental pulp stem cell，DPSC）在牙齒的修復再生研究中扮演重要角色［1］。Notch、Wnt等多種信號轉導通路可調節DPSC的增殖及分化。其中Wnt信號通路在牙齒發育的信號調控和牙齒再生等醫學工程研究中發揮重要作用。Wnt信號途徑中的重要因子Wnt1、腺瘤樣息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、β-連環蛋白（β-catenin）可影響牙上皮和間充質的相互作用及牙本質與牙根的發育、增殖和分化［2］。我們前期實驗［3］發現大鼠牙乳頭細胞在體外與DPSC分層共培養可促進DPSC的增殖能力，為探討這一生物學過程的細胞內分子機制，我們檢測了牙乳頭細胞和DPSC分層共培養后Wnt通路的表達情況。

本研究擬用原代培養大鼠DPSC與牙乳頭細胞建立DPSC和牙乳頭細胞的分層共培養體系，探討牙乳頭細胞對大鼠DPSC中Wnt信號分子表達的影響，為DPSC增殖方面的研究提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

Sprague-Dawley健康雄性4周齡大鼠和Sprague-Dawley出生后1 d大鼠，由中國醫科大學實驗動物中心提供。DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco 公司；Wnt1、APC、β-catenin 一抗 購自 Santa Cruz公司。二抗購自北京中山生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 DPSC和牙乳頭細胞分層共培養體系建立：參照文獻［4，5］原代培養大鼠DPSC和牙乳頭細胞，取對數生長期的細胞用于實驗。PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，加入含血清培養基，將細胞從培養瓶壁上吹落并分散成單細胞懸液。將Transwell小室放入24孔板中，分層培養組下室接種DPSC，上室接種牙乳頭細胞，培養基為10%胎牛血清的DMEM/F12，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養。實驗隨機分為DPSC培養對照組、DPSC+牙乳頭細胞分層培養體系組、分層培養體系組+DKK-1組（DKK-1終濃度為50 ng/mL，作用48 h）。

1.2.2 DPSC及牙乳頭細胞免疫組化鑒定：24孔板內細胞經PBS清洗后，4%多聚甲醛中4℃固定24 h。PBS漂洗3次。滴加0.1%Triton X-10050 μL，室溫放置8 min。PBS漂洗3次。3%H2O2室溫孵育15 min，山羊血清封閉，室溫孵育15 min。一抗孵育：兔抗鼠牙本質涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）1∶100，兔抗鼠波形絲蛋白（vimentin）1∶100，兔抗鼠角蛋白（cytokeratin）1∶150。生物素標記山羊抗兔二抗孵育后。辣根酶標記，DAB顯色，蘇木素復染、鏡檢。

1.2.3 RT-PCR 法 檢 測 DPSC 中 Wnt1、APC、βcateninmRNA的表達：各組細胞培養5 d后，提取細胞總RNA，將得到的RNA樣本進行反轉錄，以得到對應的cDNA。建立PCR反應體系，引物信息如表1，PCR 反應程序如下：95℃變性5 min，95℃20 s，60℃20 s，72℃30 s共30個循環，72℃延長5 min。然后瓊脂糖凝膠電泳，利用Bio-Rad凝膠成像儀成像和Fluor Chen V2.0 Stand Alone軟件對圖像進行分析，以β-actin為內參照，結果以整合光密度值（integrated density value，IDV）比值表示。

1.2.4 Western blot方法檢測 DPSC中 Wnt1、APC、β-catenin蛋白的表達：各組細胞培養5 d后，PBS沖洗，加入RIPA裂解液收集細胞，4℃、12000 r/min離心10 min，取上清液采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。取各組的等量蛋白進行SDSPAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉2 h后，按不同比例稀釋的一抗中4℃孵育過夜。經TTBS充分洗膜后，二抗孵育45 min。ECL底物發光顯色。以β-actin為內對照，所得圖像掃描后，采用Fluor Chen2.0軟件進行定量分析，測得IDV值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 DPSC及牙乳頭細胞的培養及鑒定

大鼠DPSC為成纖維細胞樣細胞，多數呈長梭形，細胞核較大。牙乳頭細胞，形態可呈多角形、三角形等，細胞體積較小。牙乳頭細胞胞質中Cytokeratin染色陰性、Vimentin染色陽性。DPSC中DSP染色陰性、Vimentin染色陽性，見圖1。

2.2 RT-PCR結果

結果顯示：分層共培養組較DPSC培養對照組Wnt1、β-cateninmRNA 的表達顯著增強（P<0.01）。DPSC和牙乳頭細胞分層培養下，給予Wnt信號通路抑制劑DKK-1干預DPSC，結果顯示DPSC中Wnt1、β-cateninmRNA的表達與未干預組比較均顯著降低（P<0.01）。而分層共培養組中APCmRNA與DPSC培養組或給予DKK-1組比較均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

2.3 Western blot結果

與DPSC培養對照組比較，分層共培養組Wnt1、β-catenin蛋白的表達顯著增強（P<0.01）。給予DKK-1干預DPSC后，分層共培養組DPSC中Wnt1、β-catenin蛋白的表達較未給予抑制劑組顯著降低（P<0.01）。分層共培養組中APC蛋白與DPSC培養對照組或給予DKK-1組比較均無統計學差異（P＞0.05），見圖3。

3 討論

本研究RT-PCR和Western blot實驗結果顯示大鼠牙乳頭細胞和DPSC分層共培養5 d后，牙乳頭細胞和DPSC分層共培養可顯著增加DPSC中Wnt信號分子Wnt1、β-catenin基因和蛋白的表達，提示Wnt信號通路的激活可能參與了牙乳頭細胞促進DPSC的增殖作用。

目前各種義齒仍然是缺失牙齒的主要修復方法，但它們也存在各種問題［6］，而牙齒的再生是目前口腔醫學中面臨的難題之一，它對于口腔醫學研究領域的發展具有劃時代的意義。盡管人們利用生物組織工程技術進行器官再造、組織再生及牙齒再生已經多年，但是目前全球牙齒再生的研究現狀還遠遠達不到能夠提供組織工程牙齒供臨床應用［7］。種子細胞是牙齒組織工程的重要條件，可用于牙齒組織工程的細胞來源有DPSC、牙源性外胚間充質細胞等。DPSC位于牙髓組織內，具有自我更新的能力，可分化為成牙本質細胞。研究表明，影響DPSC增殖分化的因素包括堿性成纖維生長因子、轉化生長因子、骨形成蛋白、β-磷酸甘油、Dentonin 等［8，9］。有文獻報道［10］牙乳頭中存在能分化為成牙本質細胞的干細胞。將牙乳頭細胞在體外進行培養，不僅可以分化為成牙本質細胞，還可以誘導形成牙本質基質。我們前期實驗［3］證實大鼠牙乳頭細胞和DPSC分層共培養，牙乳頭可能分泌一些可溶性因子促進DPSC的增殖、礦化，并增加一些重要成牙標志性蛋白的表達。提示牙乳頭細胞可能通過某種作用機制促進了DPSC的增殖、分化程度。

為了進一步探討Wnt信號分子是否參與了牙乳頭細胞促進DPSC增殖作用的這一生物學過程，我們檢測了一些重要Wnt信號分子。Wnt基因家族編碼一類結構相似的分泌型蛋白，Wnt信號蛋白與細胞表面Frizzled受體作用，啟動下游信號級聯反應，實現細胞內外的信息傳遞，Wnt基因調控的信號轉導系統在胚胎發育、器官形成、牙齒發育中均起重要作用。Wnt信號通路的主要成員包括Wnt蛋白配體、Wnt受體、β-catenin、糖原合成酶激酶、軸蛋白、APC。β-catenin是Wnt信號轉導的重要中介物，APC在Wnt信號轉導途徑中亦起重要作用。Wnt/βcatenin屬于典型Wnt通路的胞內信號通路。研究發現在牙上皮和間充質的相互作用以及牙本質、牙根的發育過程中，Wnt信號都發揮著不可替代的作用［11，12］。本研究利用RT-PCR方法檢測牙乳頭細胞和DPSC分層共培養組中Wnt1、APC和β-catenin mRNA的表達，發現Wnt1、β-catenin基因表達在共培養組中顯著增強，我們又應用Western blot方法檢測了分層共培養組中Wnt1、APC和β-catenin蛋白的表達，Western blot結果與RT-PCR結果一致。

綜上所述，DPSC和牙乳頭細胞分層共培養時可能通過激活Wnt信號通路中Wnt1、β-catenin促進DPSC的增殖作用。但確切的細胞內分子機制有待進一步研究。

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