不同根管消毒藥物對糞腸球菌殺菌效果的體外研究

王雪梅，王戈，仇麗鴻，于靜濤

（1.中國醫科大學口腔醫學院牙體牙髓科，中國醫科大學口腔醫學院中心實驗室，遼寧省口腔醫學研究所牙體牙髓病學研究室，沈陽110002；2.鞍山市中心醫院口腔科，遼寧 鞍山11 4001）

糞腸球菌是根管治療后疾病中可能分離到的最多的細菌［1］。有研究表明，糞腸球菌在無營養的根管環境中能夠生存，能到達牙本質小管內部，是最難以清除的可能導致根管系統感染的微生物之一［1］。目前氫氧化鈣是牙髓治療中最常用且最有效的抗菌消毒劑，然而一些研究顯示，糞腸球菌能在堿性環境中存活，耐受氫氧化鈣的高堿性，在用氫氧化鈣封藥的根管中存活下來［2］。因此，一些學者質疑氫氧化鈣是否可以減少糞腸球菌的數量。Basrani等［3］發現洗必泰不僅抗菌效果很好，并且可以對氫氧化鈣的耐藥菌株發揮作用。洗必泰還可以對根管中的牙本質發揮長期的抗菌作用。但是洗必泰溶液無法作為根管內的消毒藥物，國內亦無成品洗必泰凝膠。本研究配制出2%洗必泰凝膠，并研究其對糞腸球菌的殺菌效果，驗證其作為再治療根管消毒藥物的可行性。

1 材料與方法

1.1 離體牙準備

選擇因正畸需要或牙周病拔除的單根管牙60顆。要求根尖孔已發育完全，沒有近髓的齲壞或充填體，未進行過根管治療，無根裂等其他缺陷。去凈牙根周圍的軟組織和牙石，洗干凈后浸泡在生理鹽水中4℃保存備用。

1.2 實驗菌株

標準糞腸球菌菌株（Enterococcus faecalis，ATCC29212）由廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.3 感染根管模型的建立

截去牙冠，根管標準化長度為12 mm，去除牙髓組織，用15#K銼通暢根管。ProTaper鎳鈦銼預備至F3，用3M復合樹脂封閉根尖孔。然后將牙根浸泡于盛有1 mL無菌BHI液體培養基的Eppendorf管中，在121℃、1.5 MPa高溫高壓條件下滅菌15 min，隨機選取2個標本用以檢測滅菌效果。將配制好的菌液按照每個根管100 μL在30 min內接種完畢。將所有標本放在CO2恒溫培養箱內37℃條件下培養，隔日更新培養基至21 d。第2l天時用API20strep試劑盒進行生化鑒定，顯示無雜菌污染，證明感染根管模型建立成功。

1.4 分組處理及樣本采集

將已感染糞腸球菌的模型隨機分為A、B、C、D 4組，每組15顆牙，分別用注射方法將生理鹽水（A組）、Vitapex（B組）、2%洗必泰（C組）、2%洗必泰凝膠（D組）注滿根管內，直至溢出為止，所有操作均在無菌條件下進行，Caviton暫封。將4組標本放在37℃下CO2孵育箱中培養7 d，然后去除暫封，5 mL無菌蒸餾水沖洗根管2次。

1.5 細菌菌落計數

用消毒好的30#紙尖分別在封藥前、后進行取樣，插入根管內停留1 min，吸出根管內液體，放入盛有1 mL無菌生理鹽水的Eppendorf管中，震蕩1 min，取Eppendorf管中0.5 mL液體，10倍系列稀釋，分別接種在BHI瓊脂平皿上，置37℃下CO2孵育箱中培養48 h，計數菌落形成單位（CFU/mL）。

1.6 統計學處理

將細菌計數結果按lg（菌落形成單位+1）做對數轉換，選用SPSS13.0統計軟件進行分析。通過單因素方差分析比較各組感染根管糞腸球菌菌落形成單位減少量的差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

48 h后觀察見菌落生長良好、光滑，A組菌落數量明顯多于B、C、D組，與B組相比C、D組菌落數量減少（圖1）。

統計學結果顯示，封藥前4組根管內細菌量的差異無統計學意義（P>0.05）。A組封藥前后根管內細菌量無統計學差異（P>0.05），B、C、D組封藥后根管內細菌量明顯減少，與封藥前比較差異有統計學意義（P<0.05）。B、C、D組與A組比較，C、D 組與B組比較，封藥后根管內細菌量明顯減少（P<0.05），封藥前后細菌量的差值明顯升高（P<0.05），但C組與D組比較，封藥后根管內細菌量及封藥前后細菌量的差值無統計學差異（P>0.05）。結果提示，C組與D組的抗菌效果明顯優于A組和B組。見表1。

3 討論

根管治療的目的是徹底地消毒根管，杜絕再感染，并進行嚴密的三維充填。在無菌條件下，按照標準操作原則進行的根管治療其成功率可達到85%～90%，臨床上有些X線顯示根充完善的患者仍會出現疼痛、X線片顯示根尖陰影未消甚至擴大的現象，這主要是由于充填后的根管內仍存有微生物。研究發現再感染的根管中，糞腸球菌是主要的致病菌，其主要以生物膜形式存在［4～6］。這可能是由于糞腸球菌能夠滲透到根管的分叉區、不規則區，能夠進入到牙本質小管內，常規的化學—機械預備方法對糞腸球菌作用不明顯，甚至能定植于牙本質小管內部，使已充填的根管發生再次感染。有研究發現通過機械的方法預備后糞腸球菌的總量減少，但不能完全去除，而且不同的預備技術和不同器械消除細菌的能力沒有顯著性差異［7］。因此，我們試圖用根管沖洗和根管內封藥減少糞腸球菌的數量，提高再治療根管和難治性根管的成功率。

為了在復診期間減少根管內剩余微生物的數量，臨床上多采用根管內封藥的方法。目前，臨床上常用的根管消毒藥物是氫氧化鈣，其對感染根管內的大部分細菌都有殺滅作用，其原理是通過緩慢釋放OH－，提高組織的pH值，從而破壞細菌的細胞膜發揮殺菌作用，但對糞腸球菌的作用不明顯，原因可能是氫氧化鈣所釋放的OH－不能到達牙本質小管的深處，糞腸球菌可以耐受強堿環境，導致根管持續感染［8］。本實驗選用Vitapex糊劑作為陽性對照組，其主要成分為碘仿、氫氧化鈣、硅酮油，其中氫氧化鈣是發揮抗菌作用的主要成分，因其采用注射加壓進行根管內封藥，操作簡單，避免氫氧化鈣封藥不完全的不足，在臨床工作中應用較多。

氯已定是目前公認的有效抗厭氧菌感染的藥物［9］，可以直接接觸細菌，破壞細胞膜，使胞內容物外溢而發揮殺菌作用。研究認為2%洗必泰是糞腸球菌的有效殺菌劑，糞腸球菌感染的根管與2%洗必泰共同培養7 d后，根管內無法檢測出活的細菌［10，11］。但是洗必泰溶液不宜進行根管內封藥，無法發揮其效果，本研究將自己配制的2%洗必泰凝膠用于根管消毒，結果發現封藥后2%洗必泰組細菌量為0.69±0.46，2%洗必泰凝膠組為0.71±0.52，兩者相比無統計學差異，但均明顯低于Vitapex組（2.87±0.42）和生理鹽水組（4.87±0.32），表明兩者能夠有效的殺滅糞腸球菌。

本研究發現2%洗必泰與2%洗必泰凝膠抑制糞腸球菌的作用無統計學差異（P>0.05），且抗菌效果明顯優于Vitapex糊劑和生理鹽水，是再治療根管理想的消毒藥物，在氫氧化鈣效果不佳的難治性根管治療中可以發揮重要作用。

［1］Nair PN.On the causes of persistent apical periodontitis：a review［J］.Int Endod J，2006，39（4）：249-281.

［2］Evans M，Davies JK，Sundqvist G，et al.Mechanisms involved in the resistance of Enterococcus faecalis to calcium hydroxide［J］.Int Endod J，2002，35（3）：221-228.

［3］Basrani B，Tj覿derhane L，Santos JM，et al.Efficacy of chlorhexidineand calcium hydroxide-containing medicaments againstEnterococcus faecalisin vitro［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2003，96（5）：618-624.

［4］孫瑩瑩，于靜濤，劉揚，等.不同消毒方法對感染根管內糞腸球菌抗菌性的研究現狀［J］.中國實用口腔科雜志，2011，12（4）：759-761.

［5］Vivacqua Gomes N，Gurgel Filho ED，Gomes BP，et al.Recovery of Enterococcus faecalisafter single or multiple visit root canal treatments carried out in infected teeth ex vivo［J］.Int Endod J，2005，38（10）：697-704.

［6］文靜，范兵.根管內糞腸球菌感染的研究進展［J］.國際口腔醫學雜志，2007，34（1）：13-15.

［7］Matos Neto M，Santos SS，Le觔o MV，et al.Effectiveness of three instrumentation systems to removeEnterococcus faecalisfrom root canals［J］.Int Endod J，2012，45（5）：435-438.

［8］Evans M，Davies JK，Sundqvist G，et al.Mechanisms involved in the resistance ofEnterococcus faecalisto calcium hydroxide［J］.Int Endod J，2002，35（3）：221-228.

［9］黃海卿，石四箴.洗必泰保護漆的應用［J］.上海醫學，2005，28（5）：435-437.

［10］Gomes BP，Vianna ME，Matsumoto CU，et al.Disinfection of guttapercha cones with chlorhexidine and sodium hypochlorite［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2005，100（4）：512-517.

［11］Basrani B，Santos JM，Tj覿derhane L，et al.Substantive antimicrobial activity in chlorhexidine-treated human root dentin［J］.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2002，94（2）：240-245.