羅漢果甜苷干預棕櫚酸致胰島B細胞氧化應激相關損傷的機制研究Δ

陳善源，鄧立東，徐 勤，馮樂平，黃嵐珍，于冉冉（桂林醫學院，廣西桂林 541004）

羅漢果甜苷（Mogrosides）是一組含三萜苷元（羅漢果醇，Mogrol）和不同數目葡萄糖殘基的糖苷，為葫蘆科植物羅漢果（Siraitia grosvenorii）提取物的主要甜味成分[1]。羅漢果甜苷對四氧嘧啶復制的糖尿病模型動物有抗氧化和控制血糖水平的作用[2]，而對正常動物的血糖無顯著作用[3]。近年研究[4]提出胰島素抵抗導致的血糖血脂水平調節紊亂可使胰島B細胞處于持續的氧化應激狀態，活化叉頭框蛋白-1（FOXO1）等轉錄因子，抑制葡萄糖代謝和胰島素合成，損害胰島素分泌功能并導致凋亡。羅漢果甜苷可能通過抗氧化作用保護胰島B細胞的胰島素分泌功能并控制糖尿病動物模型的血糖水平，但具體作用機制的研究尚未見文獻報道。本研究通過觀察羅漢果甜苷干預棕櫚酸導致的胰島B細胞氧化應激損傷效應，初步探討羅漢果甜苷通過抗氧化作用保護胰島B細胞的機制，為今后進一步闡明羅漢果甜苷的降血糖機制奠定堅實的理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SW-CJ-2F型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；Galaxy 170 S型CO2細胞培養箱（德國Eppendorf公司）；FACSAriaⅢ流式細胞儀（美國BD公司）；Tprofessional PCR儀（德國Biometra公司）；DYY-6D型瓊脂糖電泳儀（北京六一儀器廠）；JS-780型凝膠成像儀（上海培清科技有限公司）。

1.2 試藥

羅漢果甜苷（桂林萊茵生物科技股份有限公司，其中羅漢果甜苷含量為50%）；棕櫚酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；低糖Dulbecco's改良Eagle's培養基（DMEM）培養液、高糖DMEM培養液、胎牛血清（美國Thermo Scientific公司）；0.5%含乙二胺四乙酸（EDTA）、胰酶與D-Hank’s溶液（美國Invitrogen公司）；二氯熒光素雙酯（DCFH-DA）法活性氧檢測試劑盒、異硫氰酸熒光素（FITC）標記Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）；超純RNA提取試劑盒、HiFi-MMLV逆轉錄cDNA合成試劑盒與2x Es Taq Mastermix PCR試劑盒（北京康為世紀生物技術有限公司）。

1.3 細胞

小鼠胰島B細胞系NIT-1細胞由桂林醫學院馮樂平教授研究組惠贈。

2 方法

2.1 NIT-1細胞培養與傳代

NIT-1細胞培養于含10%胎牛血清與抗生素（100 u·mL－1青霉素和100 μg·mL－1鏈霉素）的低糖DMEM培養液中，置37℃、5%CO2恒溫培養箱內傳代培養。細胞占據培養瓶瓶底面積80%左右時以胰酶消化并離心收集細胞，計數后按每孔30萬細胞接種至六孔板，加培養液至每孔總液體量為2 mL。培養48 h，細胞占據50%～60%培養孔底面積后，按表1分組，為每組更換培養液，每組3個復孔，培養48 h后收集細胞進行試驗。各處理組培養液組成見表1。

表1 各處理組培養液組成Tab 1 Content of cultivate medium for each group

牛血清白蛋白溶液中牛血清白蛋白濃度為50 g·L－1。羅漢果甜苷溶液濃度按羅漢果甜苷的含量計算為40 mmol·L－1。棕櫚酸牛血清白蛋白溶液中棕櫚酸濃度為4 mmol·L－1，牛血清白蛋白濃度為50 g·L－1，溶劑均為高糖DMEM培養液。

各組培養環境中均含有9.375 g·L－1牛血清白蛋白；羅漢果甜苷對照組和干預組均含有1 mmol·L－1羅漢果甜苷；模型組和羅漢果甜苷干預組中均含有0.75 mmol·L－1棕櫚酸。

2.2 流式細胞術測定NIT-1細胞內活性氧自由基（ROS）含量與凋亡率

細胞加藥處理完畢后，一部分加入適量無血清高糖DMEM培養液洗滌，每孔加入1 mL無血清高糖DMEM培養液與DCFH-DA工作液1 μL，混勻后置于培養箱內孵育30 min，孵育完畢后洗滌，胰酶消化后制成細胞懸液；一部分制成細胞懸液后按FITC-Annexin V凋亡檢測試劑盒的操作說明對凋亡細胞進行標記。標本處理完畢后上流式細胞儀檢測。DCF熒光強度值即可看作判斷ROS含量高低的指標。

2.3 半定量逆轉錄PCR測量細胞葡萄糖轉運受體（GLUT）-2與丙酮酸激酶編碼基因相對表達水平

細胞加藥處理完畢后，以D-Hank’s平衡鹽液洗滌2次，按RNA抽提試劑盒說明操作，提取細胞中的總RNA。各樣本總RNA經測量RNA濃度后，按照逆轉錄和PCR試劑盒說明操作，逆轉錄生成各樣本的cDNA片段，再對cDNA片段進行半定量PCR。PCR產物以最大電壓250 V、最大電流400 mA的參數在2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，在凝膠成像儀中拍攝電泳條帶照片。PCR反應所使用的引物序列見表2。

表2 PCR反應所使用的引物序列Tab 2 Primer sequence for PCR assay

2.4 數據處理

流式細胞儀數據以FlowJo 7.6流式細胞術數據分析軟件進行分析處理；半定量逆轉錄PCR所得電泳灰度圖片以Gel-Pro Analyzer 4分析并獲取各條帶的積分光密度值（IOD），使用IOD在Excel中求得各樣本目的基因的相對表達強度（相對表達強度計算公式：相對表達強度＝目的基因條帶IOD/內參基因條帶IOD）。上述數據匯入SPSS 11.0軟件中，使用單因素方差分析進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 羅漢果甜苷對高脂環境中B細胞內ROS含量的影響

與空白對照組比較，模型組NIT-1細胞內的ROS含量顯著增加（P＜0.05）；羅漢果甜苷對照組細胞內的ROS含量顯著減少（P＜0.05）。與模型組比較，羅漢果甜苷干預組NIT-1細胞內的ROS含量顯著減少，表明羅漢果甜苷可顯著降低NIT-1細胞內ROS含量，對棕櫚酸導致的NIT-1細胞內ROS增加的抑制作用更為顯著。各組DCF熒光強度比較見表3。

表3 各組DCF熒光強度比較（±s，n＝3）Tab 3 Comparison of DCF fluorenscence strength in each group（±s，n＝3）

表3 各組DCF熒光強度比較（±s，n＝3）Tab 3 Comparison of DCF fluorenscence strength in each group（±s，n＝3）

與空白對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別空白對照組羅漢果甜苷對照組模型組羅漢果甜苷干預組DCF熒光強度值190±5.20148±3.61＊490±8.33＊305±9.07＊#

3.2 羅漢果甜苷對高脂環境中B細胞糖代謝關鍵基因表達水平的影響

對各樣本總RNA的逆轉錄PCR均成功合成出PCR產物，分別為小鼠磷酸甘油醛脫氫酶編碼基因gapdh的315 bp產物、小鼠GLUT-2編碼基因slc2a2的174 bp產物和小鼠丙酮酸激酶編碼基因pklr的205 bp產物。

與空白對照組比較，羅漢果甜苷對照組slc2a2基因相對表達水平顯著降低（P＜0.05）；模型組slc2a2基因相對表達水平降低更顯著（P＜0.05），同時pklr基因相對表達水平也顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，羅漢果甜苷干預組上述指標均顯著增強（P＜0.05）。各組糖代謝關鍵基因表達水平的比較見表4；半定量逆轉錄PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。

表4 各組糖代謝關鍵基因表達水平的比較（±s，n＝5）Tab 4 Comparison of relative gene expression level of glucose metabolism in each grou（p±s，n＝5）

表4 各組糖代謝關鍵基因表達水平的比較（±s，n＝5）Tab 4 Comparison of relative gene expression level of glucose metabolism in each grou（p±s，n＝5）

與空白對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別空白對照組羅漢果甜苷對照組模型組羅漢果甜苷干預組pklr基因相對表達水平10.87±0.160.18±0.06＊0.71±0.21＊#slc2a2基因相對表達水平10.67±0.23＊0.34±0.14＊0.87±0.15#

3.3 羅漢果甜苷對NIT-1細胞群落凋亡率的影響

流式細胞儀測定結果顯示，空白對照組已有5%左右的細胞自發凋亡，培養環境中存在1 mmol·L－1濃度的羅漢果甜苷對NIT-1細胞群落凋亡率無顯著影響（P＞0.05）。加入0.75 mmol·L－1的棕櫚酸后，細胞凋亡率顯著上升（P＜0.05），羅漢果甜苷對棕櫚酸所造成的凋亡增加并無顯著抑制作用（P＞0.05）。各組凋亡率比較見表5。

表5 各組凋亡率比較（±s，n＝3）Tab 5 Comparison of apoptosis percentage in each group（±s，n＝3）

表5 各組凋亡率比較（±s，n＝3）Tab 5 Comparison of apoptosis percentage in each group（±s，n＝3）

與空白對照組比較：＊P＜0.05vs.blank control group：＊P＜0.05

組別空白對照組羅漢果甜苷對照組模型組羅漢果甜苷干預組5.79±1.445.44±0.2412.80±3.83＊16.00±4.33＊凋亡率/%

圖1 半定量逆轉錄PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 1 Agarose gel electrophoresis of semi-quantitative RTPCR assay

4 討論

本研究以高糖培養基和棕櫚酸模擬機體胰島素抵抗所導致的高血脂和血糖代謝障礙產生的內環境改變，結果顯示羅漢果甜苷可顯著降低在此環境中大幅上升的NIT-1細胞內ROS含量，與文獻報道[5]相同。正常情況下細胞無法攝取完整的分子量達1287 Da的羅漢果甜苷分子，動物實驗顯示口服羅漢果甜苷后在血液中只能檢測到羅漢果醇等水解產物[5]。未水解的羅漢果甜苷能在NIT-1細胞內產生抗氧化作用的機制可能是通過細胞表面存在的糖苷酶進行水解，小分子苷元進入細胞產生抗氧化作用。

1分子羅漢果甜苷完全水解后可產生5分子葡萄糖。相當于1 mmol·L－1羅漢果甜苷劑量的羅漢果甜苷混合物水解可生成遠大于5 mmol·L－1的葡萄糖。NIT-1細胞在22.5 mmol·L－1葡萄糖的環境中培養48 h已有近5%的凋亡率，并隨葡萄糖濃度同步上升[6]。本研究中，羅漢果甜苷對照組的培養環境葡萄糖濃度可能高達30 mmol·L－1，NIT-1細胞凋亡率與空白對照組無顯著差異，顯示羅漢果甜苷的抗氧化劑活性可保護NIT-1細胞免受高濃度葡萄糖導致的氧化應激損傷。

本研究中觀察到羅漢果甜苷可以有效清除棕櫚酸產生的ROS，但不能減少棕櫚酸造成的凋亡，甚至呈現增加趨勢，這可以用“糖脂毒性”（Glucolipotoxicity）理論[7]作出解釋。高于生理水平的葡萄糖和脂類對胰島B細胞有協同損傷作用，除了產能代謝帶來的氧自由基損害外，還有蛋白糖基化和脂肪酸旁路代謝產物的毒害作用[8]參與。羅漢果甜苷的抗氧化作用只能減緩ROS產生的損傷作用，對其他損傷機制產生的凋亡效應在本研究中未見顯著影響，水解產生的葡萄糖和棕櫚酸產生協同毒害作用，使NIT-1細胞凋亡率呈上升趨勢。

半定量逆轉錄PCR結果顯示，羅漢果甜苷能促進GLUT-2與丙酮酸激酶編碼基因的表達上升，對胰島B細胞的胰島素分泌功能起到了一定的保護作用。胰島B細胞表面的GLUT-2數目不受胰島素水平的影響，當血糖上升時，葡萄糖自由進入胰島B細胞內，線粒體產生更多能量和ROS，促使含有胰島素的分泌顆粒移動至胞膜并融合、釋放胰島素[9]。棕櫚酸代謝產生的ROS可通過激活JNK信號轉導通路，促使轉錄因子FOXO1向胞核內遷移和活化[10]。在胰島B細胞中，FOXO1的活化可抑制磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶和GLUT-2等多種產能代謝相關酶的基因表達[11]，導致胰島B細胞不能對血糖變化產生有效反應，進而影響胰島素分泌功能，這可能是胰島B細胞在高糖高脂環境下的自我保護機制。棕櫚酸導致NIT-1細胞GLUT-2和丙酮酸激酶編碼基因下調表達的效應被羅漢果甜苷逆轉，表明羅漢果甜苷起到的抗氧化作用可降低NIT-1細胞氧化應激水平，可能逆轉FOXO1的活化，有助于恢復胰島B細胞的正常葡萄糖代謝能力和葡萄糖刺激后胰島素分泌（GSIS）作用。

綜上所述，羅漢果甜苷可顯著減少NIT-1細胞內因棕櫚酸代謝而上升的ROS含量，并提高被抑制的GLUT-2和丙酮酸激酶的基因表達水平。這些效應可能由于羅漢果甜苷清除細胞內ROS后使氧化應激激活的FOXO1失活所致，具體作用機制尚待進一步研究。

此外，胰島B細胞氧化應激損傷理論中的一個重要觀點是轉錄因子FOXO1活化和胰腺十二指腸同源性蛋白1（PDX1）失活，此論點已有試驗證據佐證[12]。PDX1失活可導致胰島素合成和胰島細胞再生分化能力下降[13]，羅漢果甜苷的抗氧化作用可能抑制FOXO1活化并使PDX1的活性恢復，保護胰島B細胞的胰島素合成功能和增生分化能力。羅漢果甜苷的三萜苷元結構上與甾體激素的相似性亦可能與藥理作用相關。新近研究結果[14]證明此苷元有激活腺苷酸、活化蛋白激酶（AMPK）的作用，而腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）參與胰島B細胞的胰島素釋放過程和脂代謝相關蛋白的表達和活性的調節[15]。這些作用與本研究所發現的效應之間有何相互作用均是深入研究羅漢果甜苷和其結構相似分子對胰島B細胞保護作用機制的方向。

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