RP-HPLC法同時測定利明滴眼液中維生素C和維生素B1的含量

何笑榮，姜文清，霍秀穎，崔嘉芯，鄒定（.衛生部北京醫院藥學部，北京00730；.溫州醫學院，浙江溫州35035）

利明滴眼液是《北京醫療制劑規程》[1]收載的制劑品種，該制劑具有增強眼部局部代謝的作用，可輔助治療早期白內障。目前，該制劑由于含維生素C和維生素B1等共10余種主、輔料，成分復雜，因此，對該制劑尚無理想有效的控制方法。雖然有文獻[2]報道采用高效液相色譜（HPLC）法測定復方碘化鉀滴眼劑中維生素C和維生素B1含量的方法，流動相系統以梯度洗脫方式，但這種方法在醫院制劑的檢測中易受到儀器條件限制；且該文獻的流動相中水相的比例從100%到92%，對大多數普通的C18色譜柱而言100%水相系統會縮短色譜柱壽命。為此，筆者考慮維生素C具有易氧化的結構特點，采用在流動相系統中加0.1%硫代硫酸鈉為穩定劑，并控制流動相pH在相對穩定的范圍內，建立了反相高效液相色譜（RPHPLC）法同時測定利明滴眼液中維生素C和維生素B1制劑的含量方法。經方法學驗證，此方法重復性好、專屬性強，適合醫院制劑利明滴眼液的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

2695型HPLC儀、2996型二極管陣列檢測器（DAD）、Empower數據處理系統（美國Waters公司）；XP-205電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SPX-250 IC微電腦人工氣候箱（上海博訊實業有限公司）；Milli-Q純水器（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

維生素B1對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100390-200502，純度：100%）；維生素C對照品（美國Fluka公司，批號：45002115，純度：＞99.5%）；利明滴眼液（衛生部北京醫院，批號：20101125、20110228、20110301，規格：每支10 mL，含量：維生素B1：1 mg·mL－1，維生素C：3 mg·mL－1）；甲醇為色譜純，磷酸氫二銨、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、過氧化氫、硫代硫酸鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltima C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相：甲醇-30mmol·L－1磷酸二氫銨溶液（5∶95，用磷酸調pH值至3.2），流速：0.6 mL·min－1；檢測波長：246 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備（避光操作）

2.2.1 維生素C對照品溶液。取維生素C對照品約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加0.1%硫代硫酸鈉-流動相（1∶1）溶液（以下簡稱溶劑）溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 維生素B1對照品溶液。取105℃干燥2 h的維生素B1對照品約10mg，精密稱定，其余按“2.2.1”項下方法操作，即得。

2.2.3 硫代硫酸鈉溶液。取硫代硫酸鈉約0.5 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 供試品溶液。精密量取利明滴眼液1 mL置于25 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，即得（臨用現配）。

2.2.5 陰性樣品溶液。按處方（碘化鉀3 g，碘化鈉0.5 g，氯化鈣0.6 g，維生素B11 g，維生素C 3 g，硼酸11 g，硼砂1.9 g，甲基纖維素1.5 g，硫代硫酸鈉0.5 g，羥苯乙酯0.3 g，無菌用水加至1000 mL）比例稱取除維生素C和維生素B1外的輔料適量，將其中羥苯乙酯置于100 mL三角燒瓶中，加適量的去離子水，加熱煮沸至羥苯乙酯完全溶解，放冷，將甲基纖維素撒入該溶液中放置至完全溶解，加入除維生素C和維生素B1外的其余成分，加水至100 mL，搖勻制得陰性樣品。余下操作同“2.2.4”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統適用性試驗

分別取陰性樣品溶液、維生素C和維生素B1對照品溶液、硫代硫酸鈉溶液、供試品溶液各10μL，注入色譜儀，記錄色譜圖；結果，維生素B1、維生素C和硫代硫酸鈉的保留時間分別為5.32、6.15、3.88 min，色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數按維生素B1主峰計算大于5000，詳見圖1。

圖1 系統適用性試驗色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test

2.4 專屬性試驗

分別精取利明滴眼液2 mL，共5份，其中3份分別置于10 mL量瓶中，分別加入0.1 mol·L－1鹽酸2 mL、0.1 mol·L－1氫氧化鈉2 mL和3%過氧化氫溶液5滴，放置8 h后，分別用等量的酸或堿中和。另取2份置于10 mL試管中，分別在沸水浴中加熱2 h和10000 lx照度下光照8 h。將各破壞性試驗溶液分別轉移至10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。取以上溶液各10 μL，分別進樣，記錄色譜圖。結果表明，各降解產物峰與主峰均能達到完全分離，維生素C和維生素B1的測定不受輔料和降解產物的干擾，維生素C和維生素B1主峰經二級管陣列檢測器（DAD）均檢測為單一純峰，詳見圖2。

2.5 線性關系考察（避光操作）

取維生素C約75 mg和維生素B1對照品約25 mg，分別精密稱定，置于不同的25 mL量瓶中，加溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得貯備液。將貯備液用溶劑依次分別稀釋制成每1 mL中含維生素C為7.5、15、30、60、120、240、360 μg·mL－1，維生素B1為11.92、23.84、39.73、79.46、158.91、198.64 μg·mL－1的系列濃度溶液。分別進樣10 μL，記錄色譜圖。以濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得維生素C及維生素B1的回歸方程分別為：Y＝48991 X+54372（r＝0.9996），Y＝32894 X+50335（r＝0.9998），結果表明，維生素C和維生素B1的檢測濃度線性范圍分別為7.5～360 μg·mL－1、11.92～198.64 μg·mL－1。

圖2 專屬性試驗色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of specificity test

2.6 精密度試驗

分別制備維生素C和維生素B1低、中、高3種濃度的對照溶液，其中前者濃度分別為30、120、240 μg·mL－1，后者濃度分別為20、80、160 μg·mL－1，連續進樣6次，測定維生素C和維生素B1峰面積，以峰面積的RSD計算其日內精密度；將上述溶液置于冰箱中避光保存，分別在0、1、2、3、4、5 d測定維生素C和維生素B1的峰面積。結果維生素C各濃度的日內RSD分別為1.30%、0.23%、0.43%，日間RSD分別為1.86%、1.97%、1.63%；維生素B1日內RSD分別為1.45%、0.27%、0.45%，日間RSD分別為1.38%、1.90%、1.76%，表明方法精密度良好。

2.7 重復性試驗

取同一批號樣品（批號：20110301）6份，按“2.2.4”項下方法制備成供試品溶液，進樣測定，結果6份樣品中維生素C和維生素B1含量平均值分別為2.24、1.02 mg·mL－1（n＝6），RSD分別為1.62%、1.62%。

2.8 穩定性試驗

分別精密量取利明滴眼液1、1、2 mL置于50、25、25 mL量瓶中（低、中、高濃度），用溶劑稀釋至刻度，在室溫和低溫（4℃）下避光放置，分別于0、4、8、12、24 h進樣，記錄色譜圖，計算峰面積RSD。結果，樣品在加穩定劑后常溫和低溫條件下均穩定，常溫條件下低、中、高濃度維生素C和維生素B1的RSD分別為0.63%、0.91%、1.01%和1.12%、1.02%、0.77%；低溫條件下二者RSD分別為0.63%、0.48%、0.38%和0.26%、0.58%、0.36%，表明樣品溶液在24 h內基本穩定。同樣條件不加穩定劑低溫放置24 h，低濃度的維生素C含量的RSD為4.45%，大于2%，提示加硫代硫酸鈉能增加維生素C的穩定性。

2.9 加樣回收率試驗

取“2.5”項下已知含量的樣品，精密量取10 mL置于50 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻備用。分別精密量取120 μg·mL－1維生素C對照溶液2.5 mL、360 μg·mL－1維生素C對照溶液3 mL和6 mL置于3個10 mL量瓶中，分別精密加入2 mL上述稀釋溶液，稀釋至刻度，搖勻，得加入對照品低、中、高3種濃度（30、108、216 μg·mL－1）的樣品溶液；同法用200 μg·mL－1維生素B1對照溶液，制備加入對照品低、中、高3種濃度（40、80、160 μg·mL－1）的樣品溶液。在上述色譜條件下進樣測定，計算維生素C和維生素B1的加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.10 檢測限試驗（避光操作）

分別精密稱取維生素C和維生素B1適量，用溶劑逐步稀釋，在維生素C和維生素B1濃度分別為0.75、1.1925 mg·L－1時，其信噪比（S/N）≥3，即二者檢測限分別為7.5、11.9 ng。

2.11 樣品含量測定（避光操作）

精密稱取維生素C和維生素B1對照品適量，用溶劑溶解并稀釋成每1 mL中分別約含維生素C 120μg、維生素B140μg的溶液，作為對照溶液；取利明滴眼液3批，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，以外標法計算維生素C和維生素B1的含量，結果見表2。

表2 3批樣品含量測定結果（mg·mL－1）Tab 2 Results of the content determination of 3 batches of samples（mg·mL－1）

3 討論

目前國內、外文獻報道，維生素C含量測定方法有HPLC、紫外（UV）法等[3～5]，維生素B1有離子對色譜法、分光光度法[6，7]等。而《中國藥典》2010年版二部[8]收載的維生素C制劑和維生素B1含量測定方法，由于本品處方中其他成分的干擾均不適宜本制劑。

文獻[5]報道維生素C極易氧化，在水溶液中極易被氧化（可逆）成去氫抗壞血酸，氧化的速度由pH值和氧的濃度決定，還可進一步水解成不可逆的降解產物二酮古洛酸和草酸，金屬離子如銅、鐵、鈣等可加速其氧化。本品經酸破壞、堿破壞、高溫、光照、氧化破壞的結果顯示，維生素C和維生素B1在酸性環境較為穩定，在堿性環境、加熱及光照條件下穩定性較差，尤其對氧化劑不穩定。維生素C在pH4.0最易氧化，在pH3.0和pH6.0時最穩定，故分析測定時盡量控制在pH3左右，制劑成品pH控制在6左右[5]。本品含量測定結果發現維生素C的含量偏低，維生素B1含量正常，可能與利明滴眼液在制備過程和放置過程中部分維生素C發生分解有關，提示本品應在低溫、避光、處方中加還原劑的條件下貯存則相對穩定。

穩定性試驗結果顯示，在樣品溶液稀釋過程中，溶媒中加0.1%硫代硫酸鈉溶液能明顯改善樣品中維生素C的穩定性，樣品溶液室溫與冷藏放置24 h的穩定性結果基本一致；樣品與維生素C和維生素B1對照品溶液的穩定性試驗結果顯示，2種維生素對照品溶液比樣品溶液穩定，分析可能與處方中含有的金屬離子鈣離子加速維生素C的氧化有關。

本試驗的色譜條件選擇是根據維生素C結構上有暴露的羥基，易與C18色譜柱上未被鍵合的硅醇基團發生相互作用，且金屬離子加速維生素C的氧化的特點，流動相優先選擇甲醇與磷酸二氫銨配伍。前期試驗分別考察了10、20、25、30、40、50 mmol·L－1等不同濃度的磷酸二氫銨溶液（pH 3.5）與甲醇配比時，維生素C、維生素B1與樣品中各成分的分離效果。結果隨離子濃度的升高其分離度增加，當大于30 mmol·L－1時，分離度降低，最終確定磷酸二氫銨的濃度為30mmol·L－1。將30 mmol·L－1磷酸二氫銨溶液分別調節成2.5、3.0、3.2、3.5、3.8、4.0不同pH的溶液，考察不同pH對分離度的影響，結果確定30 mmol·L－1磷酸二氫銨的最佳pH值為3.2，其分離度為5.7，峰的對稱因子在0.95～1.05之間，峰的理論板數在上述條件下相對較高。

從DAD檢測得到的紫外吸收光譜可見，維生素C和維生素B1分別在244、246 nm波長有最大吸收，由于利明滴眼液的處方中維生素B1的含量小于維生素C的含量，故選擇246 nm為檢測波長。

本試驗先后采用了3種色譜柱即Alltima C18（250 mm×4.6 mm，5μm）、Alltima C18（150mm×4.6mm，5μm）和Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行考察，結果均可達到分離度要求，可見此色譜條件對色譜柱無明顯選擇性。

本試驗所建立的RP-HPLC法，可同時測定利明滴眼液中維生素C和維生素B1的含量，方法簡便、靈敏、準確，經過方法學考察驗證，可以用于該制劑的質量控制。

[1]北京市衛生局.醫療單位制劑規程[M].北京：人民衛生出版社，1984：270.

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[3]成志強，孫成均，黎源倩.反相高效液相色譜法同時測定食品和多維片中8種水溶性維生素[J].分析化學，2001，29（9）：1068.

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[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：896、901.