HPLC法測定雙黃連制劑中連翹苷的含量

代雪平，宋漢敏（河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450003）

雙黃連類制劑處方由金銀花、黃芩、連翹3味藥材組成，具有疏風解表、清熱解毒的功效，用于外感風熱所致的感冒，有口服液、片劑、栓劑、顆粒劑、注射劑等劑型，以口服液和注射劑生產量和使用量最大。由于雙黃連類制劑所致不良反應較多[1]，對該類藥品質量控制的研究也日益增多，其中連翹的主要有效成分連翹苷的測定多采用高效液相色譜（HPLC）法[2]。2010年版《中國藥典》（一部）[3]（雙黃連口服液）及衛生部藥品標準[4]（雙黃連注射液）規定，連翹含量測定項下供試品溶液制備方法為柱層析法，方法操作流程為：精密量取本品15 mL，水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL，微熱使溶解，加中性氧化鋁1 g拌勻，加于中性氧化鋁柱（100～120目，10 g，內徑2 cm）上，用70%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮近干，殘渣用50%甲醇溶解后轉移至5 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。該方法共10個操作步驟，非常煩瑣，且耗時較長（測定周期約2個工作日），不能適應日常檢驗工作需要。筆者經過分析處方后發現，影響連翹苷測定的主要是黃酮類（以黃芩苷為代表）和有機酸類（以綠原酸為代表）等酚酸性成分，而連翹苷為木脂素類化合物，分子結構中無游離酚羥基或羧基，利用這一結構差異，革除柱層析方法，采用直接稀釋后的樣品溶液進樣，采用弱堿性流動相，使黃芩苷等酚酸類成分成鹽后在色譜柱上基本不保留，出峰較快，而連翹苷出峰時間不受影響，可以使連翹苷和其他干擾性成分得到較好分離。現將方法報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型HPLC儀，包括G1314 A VWD型紫外檢測器、G1312 A型自動進樣器、Agilent Chemstation化學工作站（美國Agilent公司）；Mettler Toledo十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒公司）。

連翹苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110821-200610）；雙黃連口服液（河南福森藥業有限公司，批號：110234；河南天地藥業有限公司，批號：20110114）；雙黃連注射液（河南福森藥業有限公司，批號：0910001、100974、1012101、1105051-1、1105091-1、1105101-1、1106351-1、1106361-1、1106371-1、1106381-1、1106401-2、1106421-2、1106431-2、1106441-2、1106451-2、1106571-3、1106581-3、1106591-3）；乙腈（德國Merck公司，色譜純）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.012 mol·L－1醋酸鈉溶液（v/v＝23∶77）；檢測波長：277 nm；流速：1 mL·min－1；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。色譜見圖1。理論板數按連翹苷計算應不低于4000。由圖1可見，在改進后的色譜條件下，供試品溶液中其他成分對連翹苷測定無干擾。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取連翹苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含0.110 mg的對照品貯備液，精密吸取貯備液10mL，置于50mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 雙黃連口服液：精密吸取雙黃連口服液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。雙黃連注射液：精密吸取雙黃連注射液5 mL，置于25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2.3 陰性對照溶液的制備 除連翹外，其余各味按處方比例取樣，分別照雙黃連口服液和注射液“制法”項下規定，制備缺連翹的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下連翹苷對照品貯備液各1、2、5、10、20、30、40、50 μL，分別注入HPLC儀，照“2.1”項下色譜條件測定連翹苷峰面積。以進樣量（X，μg）對峰面積（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y＝6.6954×102 X+3.9099（r＝0.9999）。結果表明，連翹苷進樣量在0.11～5.5 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。標準曲線基本過原點，故采用“外標一點法”測定含量。

2.4 精密度試驗

精密吸取對照品溶液（濃度為22 μg·mL－1）10 μL，照“2.1”項下色譜條件進樣，測定連翹苷色譜峰峰面積，重復測定6次，測定并計算峰面積。結果，連翹苷峰面積RSD＝0.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取雙黃連注射液（批號：0910001）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件分別于第0、1、2.5、4、5、6、7、8.5 h進樣1次，每次進樣10 μL，測定并計算峰面積。結果，連翹苷峰面積RSD＝1.7%（n＝8），表明供試品溶液在8.5 h內基本穩定。

2.6 重復性試驗

取雙黃連注射液（批號：0910001）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣10 μL，測定連翹苷含量，測定6次。結果，連翹苷平均含量為0.116 mg·mL－1，RSD＝1.7%（n＝6），表明方法重復性較好。

2.7 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的雙黃連注射液（批號：0910001，連翹苷含量：0.116 mg·mL－1）適量，共6份，每份5 mL，置于50 mL容量瓶中，分別精密加入連翹苷對照品貯備液（連翹苷含量：0.110 mg·mL－1）5 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，測定連翹苷含量，計算加樣回收率，結果見表1。連翹苷平均加樣回收率為98.8%，RSD＝0.3%（n＝6）。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取雙黃連口服液和雙黃連注射液，按“2.1”項下色譜條件測定連翹苷含量，同時按照2010年版《中國藥典》（一部）（雙黃蓮口服液）及衛生部藥品標準（雙黃蓮注射液）方法測定含量，結果見表2（2種方法測定結果基本一致）。

3 討論

雖然現代色譜柱填料制造及裝填技術的進步已經使液相色譜柱的pH適應范圍有了更大的拓展，但十八烷基硅烷鍵合硅膠填料的化學本質決定了填料在堿性流動相環境下的不穩定性。醋酸鈉為弱酸強堿鹽，其水溶液呈弱堿性，并在一定的范圍內對酸和堿有緩沖作用。筆者考察了不同濃度的醋酸鈉溶液的pH值，結合不同濃度的醋酸鈉溶液色譜分離效果，最后確定0.012 mol·L－1醋酸鈉溶液（pH 6.6）為最優，既可以滿足使黃芩苷等酚酸類成分成鹽解離而快速洗脫的目的，同時對色譜柱填料的影響最小。

本文采用含醋酸鈉溶液流動相替代原國家標準規定的酸性流動相，消除了其他成分對連翹苷在色譜柱分離過程中的干擾，因而簡化了連翹苷供試品溶液制備方法，極大地提高了檢測效率，改進后的方法連翹苷測定結果與原方法測定結果基本一致，且重復性、穩定性良好，精密度、加樣回收率均符合要求，說明改進后的方法完全可以替代原方法。

[1]方世平，楊寶玉.雙黃連粉針劑不良反應117例分析[J].中國藥房，1998，9（4）：176.

[2]聶東東，楊立娟，宋維秋.HPLC法測定雙黃連制劑中連翹苷的含量[J].中國藥房，2000，11（6）：275.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：611.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準-中藥成方制劑第十一冊[S].WS3-B-2104-96.1996：38.