多重/泛耐藥鮑曼不動桿菌分子流行病學及整合子研究Δ

李鑫，郭雷靜，陸思靜（遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121000）

多重/泛耐藥鮑曼不動桿菌（MDR-Ab/PDR-Ab）的出現，給醫院感染控制及臨床治療帶來了極大的困難，被稱為21世紀革蘭陰性菌中的“耐甲氧西林金黃色葡萄球菌”。其6個主要流行克隆株在我國廣泛流行，分布于北京、上海、重慶、沈陽及浙江省的多個城市[1]。整合子被認為是耐藥基因在水平傳播的重要因子。本研究目的在于了解我院MDR-Ab/PDR-Ab的分子流行病學及整合子是否介導了耐藥基因的傳播。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

我院微生物科2010年各類臨床標本中培養并通過MicroScan WalkAway-40全自動微生物鑒定系統及其配套的鑒定藥敏復合板鑒定為MDR-Ab/PDR-Ab的38株作為本研究重點，同一患者同一部位只統計初次分離株。

1.2 儀器與試劑

MicroScan WalkAway-40全自動微生物鑒定系統及其配套的鑒定藥敏復合板由美國Dade公司生產；引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；Taq DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、DNA Marker、dNTPs、內切酶HinfⅠ和AVaⅡ、瓊脂糖及凝膠回收試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司（大連TaKa-Ra公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Thermal Cycler 2400為美國Perkin-Elmer公司產品。

1.3 腸桿菌科基因間重復一致序列（ERIC-PCR）DNA檢測模板的制備

從LB培養基上挑取單個受試菌落加入5 mL LB培養基中，37 ℃、200 r·min－1震蕩孵育16～20 h，取上述培養菌液2 mL，采用離心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA作為模板。

1.4 ERIC-PCR

引物序列：ERIC1：5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′；ERIC2：5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′。采用25 μL反應體系：模板2 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ERIC引物各0.5 μL（25 μmol）、加無菌蒸餾水至總體積25 μL。置聚合酶鏈式反應（PCR）儀中反應，程序為：94℃預變性5 min；然后94℃變性30 s，48℃退火1 min，72℃延伸4 min，進行35個循環；最后72℃延伸6 min。用2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物在1×TBE電泳緩沖液中電泳，溴化乙錠染色，用紫外燈下觀察擴增產物，收集圖像。

1.5 整合酶基因檢測模板制備

使用煮沸法獲取DNA模板：直接挑取3～4個菌落于200 μL無菌水中，旋渦振蕩30 s，充分混勻后置沸水浴中恒溫保持10 min后取出，迅速置冰浴中放置10 min；12000 r·min－1離心5 min，取上清2 μL即為DNA模板。

1.6 整合酶基因的檢測

引物序列：IntIF 5′-TGC GGG TYA ARG ATB TKA ATT-3′；IntIB 5′-CAR CAC ATG GGT RTA RAT-3′，預擴增片段長度為491 bp。采用25 μL PCR反應體系如下：10×PCR緩沖液5 μL，dNTPs 0.5 μL，上、下游引物（20 μmol·L－1）各0.5 μL，0.125 μLTaq DNA聚合酶5 U·μL－1（TaKaRa公司），加滅菌蒸餾水至總體積25 μL，操作在冰浴中完成。置PCR儀中反應，程序為：94℃預變性5 min；然后按94℃變性1 min，51℃退火30 s，72℃延伸45 s，進行30個循環；最后72℃延伸10 min，4℃保護。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察擴增產物，出現明顯亮帶的為初篩陽性，收集圖像。陽性條帶行切膠純化后分別用內切酶（HinfⅠ、AVaⅡ）行限制性片段長度多態性分析，同時選取酶切片段長度一致的PCR純化產物測序，用BLAST程序分析。

2 結果

2.1 MDR-Ab/PDR-Ab科室及標本分布

38株MDR-Ab/PDR-Ab在ICU檢出率最高，21株，占55.3%；其次為呼吸科7株、神經外科4株、骨創傷科2株、燒傷科2株、內分泌科1株、血液科1株，分別占18.4%、10.5%、5.3%、5.3%、2.6%、2.6%。標本以下呼吸道和手術切口分離最高，分別占68.4%（26/38）%和15.8%（6/38）。

2.2 ERIC-PCR結果

ERIC-PCR產物多呈3～5條帶，主帶為2～3條，從250～1500 bp不等。38株MDR-Ab/PDR-Ab由7種基因型組成，其中 1～23為A型，占60.5%（23/38），分別來自ICU 13株，占56.5%（13/23）；呼吸科4株，占17.4%（4/23）；骨科2株，占8.7%（2/23）；血液科1株，內分泌科1株，神經內科1株，神經外科1株。37為A型的一個亞型，來自ICU。24～26為B型，24來自神經外科，25、26來自ICU。27為B型的一個亞型B1型，來自于ICU科。29、33、38為C型，29、33來自呼吸科，38來自ICU。28、36為D型，分別來自神經外科和呼吸科。30～32為E型，分別來自呼吸科、高級服務中心、ICU。34、35分別為F、G型，都來自于ICU。D、F、G型菌株的基因型無密切相關性。代表菌株ERIC-PCR結果如圖1。

圖1 ERIC-PCR結果圖Fig 1 ERIC-PCR results figure

2.3 整合酶基因檢測結果

38株MDR-Ab/PDR-Ab共檢出含整合酶基因菌株28株，經內切酶HinfⅠ、AVaⅡ酶切后證實為Ⅰ類整合子，經基因測序比對分析進一步證實為Ⅰ類整合子，檢出率為73.7%（28/38）。A型菌株整合酶基因陽性者17株，占整合酶基因陽性菌株的60.7%（17/28）。來自ICU菌株整合酶陽性菌株為17株，占ICU檢出菌株總數的的81.0%（17/21），代表結果如圖2。

圖2 整合酶基因檢測及酶切圖Fig 2 Gene detection of integrase and cleavage map

3 討論

近年來，鮑曼不動桿菌引起的感染呈增高趨勢，特別是多重耐藥（指對3種以上結構、作用機制不同的抗菌藥物耐藥）和泛耐藥（指對除粘菌素外的所有臨床上可獲得抗生素均耐藥）引起的感染，在臨床上幾乎無藥可選擇[2]，已成為嚴重的公共衛生問題。我們所研究的這些菌株僅呼吸道標本就占67.5%。因此，在對感染性疾病的管理中應加強對呼吸道感染的控制和預防，防止交叉感染及暴發流行。標本分布主要以ICU為主，分離率為55.3%。研究也發現[3]，患有嚴重基礎疾病、免疫功能低下、住院時間較長、接受侵入性操作、長期應用抗菌藥物、應用免疫抑制劑或糖皮質激素等因素均是危重患者發生多重耐藥鮑曼不動桿菌醫院感染的易感因素。

近年來，基因盒-整合子學說的提出為多藥耐藥性的研究開拓了新領域。整合子是一種新的可移動基因元件，其兩端是高度保守序列，分別稱作5′保守端、3′保守端；5′和3′端之間為可變區，是基因水平傳遞系統。根據整合子5′保守區整合酶基因的同源性差異，整合子被分為4類：Ⅰ類、Ⅱ類、Ⅲ類和Ⅳ類，其中前3類常與耐藥相關，又被統稱為耐藥整合子（RI），這些整合子可捕獲和整合細菌的外源性耐藥基因，造成多種耐藥基因在不同菌株甚至不同菌種間的水平轉移，因而與宿主菌的多藥耐藥性的發生、發展密切相關。經過對38株MDR-Ab/PDR-Ab菌株進行同源性分析發現，38株菌株分別來自7組不同分型的克隆株，整合酶基因的檢出率為60.7%（17/28）。A型克隆株是ICU的主要類型，A型克隆菌株中整合酶陽性菌株分布在ICU 11株、呼吸科3株、神經外科1株和骨科2株。檢出的2株骨科菌株的患者曾在ICU住院治療，說明科室間存在交叉感染的可能性，這種克隆傳播也可能是導致耐藥菌株不斷增加的重要原因之一。來自ICU的菌株Ⅰ類整合酶基因陽性菌株占81.0%（17/21），低于我國臺灣地區的85.0%檢出率[4]，從時間分布上看，這些菌株在全年均有分布。綜上，整合子在同一克隆株甚至在同一科室之內及不同科室之間傳播起到非常關鍵的作用，因此加強多藥耐藥菌的管理是非常必要的。

依據我們ERIC-PCR及整合酶基因檢測結果，結合國內、外研究[5～7]，我們不難發現，在不同地區的醫院內，多個相同克隆株在不同科室及個體間的相互傳播可能是醫院內鮑曼不動桿菌感染原因之一。因此，重視醫護人員手衛生、加強消毒隔離措施、合理應用抗生素是控制醫院MDR-Ab／PDR-Ab感染的重要手段。

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