LC-MS法測定人血漿中瑞格列奈的濃度及其片劑的生物等效性研究

任進民，孫 倩，殷立新，王川平，張志清，王淑梅（河北醫科大學第二醫院，石家莊 050000）

瑞格列奈（Repaglinide）為新型的短效口服促胰島素分泌降糖藥，耐受性強、安全性高，是較理想的口服降糖藥。臨床用于治療2型糖尿病，特別是合并腎功能不全的患者[1]。關于生物樣品中瑞格列奈含量的測定，已有文獻報道主要使用高效液相色譜（HPLC）法[2～5]，液-質聯用（LC-MS）法[6]則很少。筆者建立了LC-MS法測定人血漿中瑞格列奈濃度的方法，并對國產與進口瑞格列奈片的人體藥動學及生物等效性進行研究。

1 材料

1.1 儀器

API 4000型液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀，配有電噴霧離子化源和Analyst 1.4.1數據采集系統軟件（美國ABI公司）；Prominence LC-20A型液相色譜儀，配有二元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器和柱溫箱（日本島津公司）；AG-135分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；TG16-WS型離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）；GZ-20G-Ⅱ型離心機（上海安亭科學儀器廠）；SB3200型超聲波清洗儀（上海音波聲電科技公司）；ZH-2型混合器（天津藥典標準儀器廠）。

1.2 試藥

瑞格列奈對照品（批號：100753-200501）、格列齊特對照品（內標，批號：0269-9701）均購自中國食品藥品檢定研究院，含量均＞99.9%；受試制劑：瑞格列奈片（北京萬生藥業有限責任公司研制，規格：每片0.5 mg（A1），批號：S20090601；規格：每片1 mg（A2），批號：S20090604）；參比制劑：瑞格列奈片（R，丹麥諾和諾德公司（Novo Nordisk A/S，規格：每片1 mg，批號：XM70002）；甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×50 mm，5 μm），保護柱C18（4.0 mm×3.0 mm）；流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（90∶10）；流速：0.5 mL·min－1；柱溫：20 ℃；進樣量：20 μL。

離子源：電噴霧離子化（ESI）源；噴霧電壓：4500 V；霧化溫度：450 ℃；霧化氣：30 L·min－1；簾氣：20 L·min－1；碰撞氣：8 L·min－1；輔助氣：35 L·min－1；檢測方式：正離子多反應監測（MRM）；監測離子：m/z 454.4→231.5（瑞格列奈），m/z 324.1→127.2（內標，格列齊特）；碰撞誘導解離電壓：40 V（瑞格列奈）和20 V（格列齊特）；駐留時間（Dwell time）：100 ms。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液。準確稱取瑞格列奈對照品25.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得濃度為1 mg·mL－1的對照品貯備液。以空白血漿稀釋至1.0 μg·mL－1，混勻，作為對照品工作樣品。

2.2.2 內標溶液。準確稱取格列齊特對照品10.05 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，作為內標貯備液。精密吸取100 μL置250 mL容量瓶中，用甲醇定容，得400 ng·mL－1的內標工作液。

2.3 血樣處理

精密吸取100 μL血漿（標準曲線、質控樣品取健康志愿者空白血漿制備）中依次加入內標溶液（400 ng·mL－1格列齊特的甲醇溶液）100 μL、甲醇1 mL，渦流混合30 s，離心（11000 r·min－1）5 min后，取上清液200 μL裝入自動進樣器小瓶，取樣20 μL進行分析。

2.4 專屬性試驗與基質效應

2.4.1 專屬性考察。瑞格列奈和內標格列齊特的ESI一級全掃描質譜主要生成準分子離子峰[M+H]+，分別為m/z 454.4和m/z 324.1。選擇性對準分子離子峰[M+H]+進行二級質譜分析，將各待測物及內標物生成的主要碎離子用于定量分析時監測的產物離子。瑞格列奈和內標格列齊特生成的主要碎片離子為m/z 231.5和m/z 127.2。分別取6名受試者的空白人血漿100 μL，除不加內標溶液外（以甲醇代替），按“2.3”項下方法操作；將相應的瑞格列奈標準溶液加入空白血漿中制備200 ng·mL－1的血漿模擬樣品，按同法操作；另取志愿受試者用藥0.1 h后的血漿樣品100 μL，按同法操作。由血漿樣品按本法分離測定所得的色譜圖表明，空白樣品中內源性物質不干擾瑞格列奈的分析，通過與空白血樣添加標準對照品（瑞格列奈、格列齊特）色譜圖比較，確證瑞格列奈和內標的保留時間約為1.8、1.5 min。色譜圖見圖1。

2.4.2 基質效應考察。取對照品貯備液適量，用甲醇適當稀釋，分別取0.1 mL，加入空白血漿基質溶液0.9 mL，制備低、中、高濃度（1.0、10.0、160.0 ng·mL－1）的血漿模擬樣品并測定。結果基質效應分別為104%、103%、101%，RSD（n＝5）均＜1.9%；內標基質效應為104%，RSD（n＝9）均＜0.6%。

圖1 MRM圖譜Fig 1 MRM chromatograms

2.5 標準曲線的制備

取對照品工作液適量，加入空白血漿，分別稀釋成200.0、40.0、10.0、3.0、1.0、0.5 ng·mL－1的系列濃度線性工作樣品，按“2.3”項下方法操作后進樣測定，記錄色譜。以瑞格列奈與內標峰面積之比（R）為縱坐標，瑞格列奈濃度（c）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為R＝0.00925c+4.28×10－5（r＝0.9992）。結果表明，瑞格列奈血藥濃度在0.5～200.0 ng·mL－1范圍內線性關系良好。定量下限為0.5 ng·mL－1，準確度偏差為－4.9%，RSD（n＝6）為2.4%。

2.6 精密度及回收率試驗

按“2.5”項下方法制備低、中、高（1.0、10.0、160.0 ng·mL－1）濃度的血漿樣品，各6份，共4批，分別進樣測定，計算得日內、日間RSD（n＝6）及方法回收率，結果見表1。同上制備低、中、高濃度（1.0、10.0、160.0 ng·mL－1）的血漿樣品，各6份，分別測定其中瑞格列奈的峰面積S1與相應濃度瑞格列奈溶液的峰面積S2，按S1/S2×100%計算瑞格列奈的提取回收率，結果分別為83.2%、85.4%、86.6%（n＝6），內標的提取回收率為91.6%（n＝9）。

表1 回收率及精密度試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery and precision test（n＝6）

2.7 穩定性試驗

考察濃度為1.0、160.0 ng·mL－1的瑞格列奈血漿樣品分別避光室溫放置4 h、樣品處理后室溫放置24 h、凍融3次和凍存32 d的穩定性，結果瑞格列奈峰面積的RSD（n＝6）均＜6.5%，表明血漿樣品在上述條件下均穩定。

2.8 血藥濃度測定和藥動學試驗

2.8.1 研究對象。24名男性健康志愿者，年齡（20.4±1.2）歲，體重（65.1±5.9）kg，身高（172±5）cm，試驗前經體檢證實心、肝、腎功能和血糖等均正常，試驗前2周及試驗期間未用其他藥物，且無煙、酒嗜好。本試驗方案經河北醫科大學第二醫院醫學倫理委員會審核批準，志愿者均書面簽署知情同意書。

2.8.2 試驗方案。采用完全三交叉試驗設計（3×3）進行本項生物等效性研究，24名受試者隨機分為6組，每組4人，分別按A1RA2、A1A2R、A2A1R、A2RA1、RA1A2、RA2A1順序入組進行試驗，每2周期間隔為7 d，共進行3周期。根據瑞格列奈制劑的臨床常用劑量，確定本試驗的給藥劑量為4 mg。受試者于試驗當日晨空腹口服受試制劑和參比制劑，用200 mL溫開水送服，2 h內禁水，4 h后各進食標準餐1次。試驗期間保持日常輕微活動，不允許長時間臥床，并避免劇烈活動。受試者禁用其他藥及含咖啡因類成分的飲料，禁止吸煙、飲酒。

2.8.3 血樣采集。分別在服藥前取空白血樣，于服藥后0.1、0.2、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6 h各個時刻采集14個血樣：自上肢靜脈取血3 mL，注入肝素化管中，混勻后離心（轉速：3000 r·min－1）10 min，血漿樣品于－70 ℃冰箱保存待測。

2.8.4 數據處理。試驗所得瑞格列奈血藥濃度數據用DAS 2.0程序軟件計算藥動學參數，權重系數取1。數據處理方法用逐個受試者的藥-時數據作曲線擬合，求得個體參數后計算平均值。tmax、cmax取實測值，藥-時曲線下面積（AUC）由梯形法求得，消除半衰期按t1/2＝－0.693/Zeta計算。cmax及AUC值經對數轉換后作方差分析、雙單側t檢驗和90%置信區間檢驗，tmax用非參數法分析，評價受試制劑與參比制劑的生物等效性。24名受試者口服單劑量受試制劑A1、A2和參比制劑R的藥動學參數計算結果見表2；平均藥-時曲線見圖2。

表2 24名受試者口服受試制劑與參比制劑后的主要藥動學參數（n＝24）Tab 2 Main pharmacokinetic parameters of test preparations and reference preparation in 24 healthy volunteers with oral administration（n＝24）

3 討論

本試驗參考相關文獻[6]，通過優化色譜和質譜條件建立了LC-MS法測定血漿中瑞格列奈的濃度，經過方法學確證，結果表明本法專一性好、靈敏度高，準確度、精密度和線性關系良好，完全滿足藥動學和生物樣品分析測定要求。本法血樣預處理較文獻[2～4]簡便易行，甲醇直接沉淀蛋白后直接測定，無需堿化后以乙酸乙酯等有機試劑提取，并且靈敏度高、分析時間短，便于進行大樣本量的分析測定。

本文國產和進口的瑞格列奈片的主要藥動學參數無顯著差異，與文獻報道[5]相似。生物等效性統計分析結果表明，國產受試制劑A1、A2的AUC0～6h分別為93.1%～112.9%、88.0%～106.8%，cmax的90%置信區間分別91.5%～112.0%、89.1%～109.1%。按照生物等效性判斷標準，受試制劑AUC的90%置信區間落在標準參比制劑的80%～125%之間，cmax落在70%～143%之間即可認為等效，故判定受試制劑A1、A2與參比制劑具有生物等效性。受試制劑A1和A2相對于參比制劑的相對生物利用度分別為（106.5±31.1）%、（100.9±30.6）%。

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