月腺大戟與狼毒大戟對人肝癌細胞BEL-7402體外增殖的影響對比研究Δ

何華紅，王華倩，嚴(yán)小紅，李薇#（.廣州市藥品檢驗所，廣州5060；.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣州50006）

中藥材種類繁多，異物同名、一藥多源現(xiàn)象（多基源）給中藥材標(biāo)準(zhǔn)制訂和質(zhì)量評價造成了極大的不便。隨著中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的深入，藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升，多基源品種標(biāo)準(zhǔn)單列，一物一名是大勢所趨。我國是中藥材大國，為擴大藥源，滿足制藥工業(yè)等需要，《中國藥典》全面取消多基源品種的收載并不現(xiàn)實。但為了實現(xiàn)規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，在科學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對多源性品種進行逐步的限制很有必要。化學(xué)成分或藥理、藥效差別甚遠的多基源藥材并列為一味藥材并不合理，這必然會導(dǎo)致品種混亂和臨床安全的不可控。

狼毒是2010年版《中國藥典》（一部）正式收載的一類多基源中藥材，其定義為大戟科植物月腺大戟（Euphorbia ebractedata）或狼毒大戟（Euphorbia fischeriana）的干燥根[1]。據(jù)文獻查詢和本課題研究結(jié)果表明，月腺大戟和狼毒大戟在毒理和藥理、藥效方面頗多不同，2010年版《中國藥典》籠統(tǒng)將其收錄定義為同一藥材似有不妥，以現(xiàn)代藥理方法對其進行毒理和藥理、藥效對比研究可以達到正本清源目的。據(jù)2010年版《中國藥典》記載，狼毒有散結(jié)的功效，結(jié)在中醫(yī)泛指一切有形的腫塊或是氣象不暢等證，有形的腫塊有惡性腫瘤、良性腫瘤、囊腫、淋巴結(jié)腫大、皮下結(jié)節(jié)、皮疹等。本文主要對月腺大戟和狼毒大戟體外抗腫瘤活性進行對比研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Axiovert 40CFI型倒置顯微鏡（德國蔡氏公司）；Nu-425-400 E型生物安全柜、Nu-4750 E型CO2培養(yǎng)箱（美國Nuaire公司）；Versa Max型連續(xù)波長酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；RE-301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海予正儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

月腺大戟購于安徽省亳州藥材市場，狼毒大戟由康臣藥業(yè)有限公司提供，均經(jīng)廣州市藥品檢驗所中藥室劉柏英主任藥師鑒定為真品；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：100226）；MTT（德國Sigma公司，批號：091206）；胰蛋白酶（廣州標(biāo)邁生物科技有限公司，批號：201001）；注射用環(huán)磷酰胺（CTX，山西普德藥業(yè)股份有限公司，批號：20090902）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠40只，體重180～200 g，♀♂兼半，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2008-0003）。

1.4 細胞株

人肝癌細胞株BEL-7402（購于中科院上海生命科學(xué)研究所細胞庫），以RPMI1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100IU·mL－1青霉素與100 IU·mL－1鏈霉素），37℃、5%CO2、飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)，傳代。

2 方法

2.1 受試物的制備

藥材打粉，37℃烘干，稱取適量藥粉，乙醇超聲提取（2次，每次30 min，濾液無色），定性濾紙過濾，收集濾液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，收集濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去殘留溶劑得浸膏，稱取適量浸膏，用適當(dāng)濃度的吐溫80制成混懸液，備用。

2.2 分組與含藥血清制備[2～4]

實驗分為9組，即空白對照（等容生理鹽水，ig）、溶劑對照（等容吐溫80，ig）、CTX（100 mg·kg－1，ip）和月腺大戟高、中、低劑量（0.97、0.485、0.2425 g·kg－1，ig）以及狼毒大戟高、中、低劑量（0.05、0.025、0.0125 g·kg－1，ig）組。實驗前禁食12 h，參考筆者以前急性毒性實驗數(shù)據(jù)，月腺大戟和狼毒大戟均以其半數(shù)致死量（LD50）的1/5為高劑量（月腺大戟醇提浸膏為0.97 g·kg－1；狼毒大戟醇提浸膏為0.05 g·kg－1），1∶0.5為劑間比。每天給藥1次，連續(xù)3 d。于末次給藥后1 h在無菌條件下自腹主動脈采血，4℃下靜置過夜，3500 r·min－1離心30 min，分離血清，將各組內(nèi)大鼠血清等量混勻，56℃、30 min滅活，0.22μm濾膜過濾除菌，－20℃貯藏，備用。

2.3 MTT比色法測定生長抑制率（IR）[5]

BEL-7402細胞株常規(guī)培養(yǎng)，取生長旺盛對數(shù)生長期細胞常規(guī)消化，用新鮮含血清培養(yǎng)液配制成1×104個/mL，96孔板各孔加細胞懸液100 μL，37℃、5%CO2、飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)，24 h后換成無血清的培養(yǎng)基，加入受試血清（每孔10 μL），各組均設(shè)6個復(fù)孔，另設(shè)置正常無血清的培養(yǎng)液空白對照組6孔（每孔100 μL），調(diào)零孔6孔（每孔只加100 μL無血清的培養(yǎng)液，不加細胞），繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，觀察細胞形態(tài)。每孔加5 mg·mL－1的MTT溶液20 μL，置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)5 h，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入200 μL二甲基亞砜（DMSO），慢速振蕩10 min，于酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測光密度（A）值，取6孔平均值。根據(jù)下式計算細胞IR：IR（%）＝（1－實驗組A值/空白對照組A值）×100%。

2.4 集落形成試驗[6]

BEL-7402細胞株常規(guī)培養(yǎng)，取生長旺盛對數(shù)生長期細胞常規(guī)消化，用新鮮含血清培養(yǎng)液分級稀釋，配制成200個/mL懸液，按每皿200個細胞接種于培養(yǎng)皿中，十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，均勻分散細胞，37℃、5%CO2、飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，換成無血清的培養(yǎng)液，加入受試血清（每皿20 μL），各組均設(shè)3個復(fù)皿，常規(guī)培養(yǎng)2周，至肉眼可見克隆，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用PBS小心浸洗2次，每皿加純甲醇5 mL固定15 min，棄去固定液，加適量姬姆薩應(yīng)用液染色15 min，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，肉眼數(shù)克隆數(shù)，當(dāng)不能分辨時在倒置顯微鏡下觀察，以＞50個細胞計數(shù)為1個克隆。按下式計算克隆形成率：克隆形成率（%）＝克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，MTT比色法檢測采用雙側(cè)t檢驗，集落形成試驗采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 含藥血清對腫瘤細胞形態(tài)學(xué)的影響

倒置顯微鏡下觀察可見，空白對照組與溶劑對照組細胞形態(tài)正常，密度大，細胞呈梭形，邊緣清晰、光滑，貼壁性好；CTX組細胞貼壁差，細胞變圓，漂浮較多；狼毒大戟低劑量組細胞形態(tài)變化不大，貼壁性好，邊緣清晰、光滑；狼毒大戟中劑量組細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞邊緣不齊；狼毒大戟高劑量組細胞貼壁更差，細胞變圓較多，漂浮細胞多見；月腺大戟各組細胞基本無明顯變化。

3.2 含藥血清對BEL-7402細胞增殖的影響

高、中劑量狼毒大戟能顯著抑制BEL-7402細胞體外增殖，且其抑制效應(yīng)呈劑量正相關(guān)；月腺大戟對BEL-7402細胞體外增殖無明顯抑制作用。高、中劑量狼毒大戟能顯著抑制BEL-7402細胞體外增殖，降低克隆形成率且其抑制效應(yīng)呈劑量正相關(guān)；月腺大戟對BEL-7402細胞體外增殖和克隆形成率無明顯抑制或降低作用。A與IR測定結(jié)果見表1；克隆數(shù)與克隆形成率測定結(jié)果見表2。

表1 A與IR測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Determination ofAand IR（±s，n＝6）

表1 A與IR測定結(jié)果（±s，n＝6）Tab 1 Determination ofAand IR（±s，n＝6）

與空白對照組比較：＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01

組別空白對照組溶劑對照組CTX組狼毒大戟高劑量組狼毒大戟中劑量組狼毒大戟低劑量組月腺大戟高劑量組月腺大戟中劑量組月腺大戟低劑量組劑量/g·d·kg--0.10000.05000.02500.01250.97000.48500.2425 A 0.835±0.0320.796±0.0360.263±0.037＊0.241±0.015＊0.583±0.060＊0.810±0.0260.805±0.0370.813±0.0240.851±0.015 IR/%- 570＊72＊32＊4443

表2 克隆數(shù)與克隆形成率測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 2 Determination of amount and formation rate of clone（±s，n＝3）

表2 克隆數(shù)與克隆形成率測定結(jié)果（±s，n＝3）Tab 2 Determination of amount and formation rate of clone（±s，n＝3）

與空白對照組比較：＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01

組別空白對照組溶劑對照組CTX組狼毒大戟高劑量組狼毒大戟中劑量組狼毒大戟低劑量組月腺大戟高劑量組月腺大戟中劑量組月腺大戟低劑量組劑量/g·d－1·kg－1--0.10000.05000.02500.01250.97000.48500.2425克隆數(shù)103.67±3.52110.00±2.2620.34±3.15＊31.34±5.01＊48.50±4.11＊95.68±6.1091.26±3.5196.55±5.20106.33±2.80克隆形成率/%51.855.010.2＊15.7＊24.2＊47.845.648.353.2

4 討論

狼毒體外抗腫瘤藥效研究頗多，但存在幾個問題：一是沒有系統(tǒng)對比狼毒大戟和月腺大戟的體外抗腫瘤活性；二是多采用動物瘤株進行研究，存在人和動物的種屬差異問題；三是多采用粗提物直接外加于體外培養(yǎng)細胞，這樣一些非生理環(huán)境如中藥粗制劑的雜質(zhì)、電解質(zhì)或鞣質(zhì)所引起的培養(yǎng)液滲透壓和pH等的改變會影響細胞的生長，導(dǎo)致一些假陽性的結(jié)果出現(xiàn)[2]。

采用血清藥理學(xué)方法，取含藥血清作用于體外培養(yǎng)人腫瘤細胞株可以克服以上的一些不足，較好地反映出狼毒體外抗腫瘤藥理活性。通過系統(tǒng)對比狼毒大戟和月腺大戟的體外抗腫瘤活性，可以看出其不同點，為中藥狼毒藥材標(biāo)準(zhǔn)制訂提供參考。

研究結(jié)果表明，狼毒大戟與月腺大戟對于人肝癌細胞BEL-7402體外增殖抑制活性有很大區(qū)別，狼毒大戟作用活性明顯強于月腺大戟。2010年版《中國藥典》籠統(tǒng)將其收錄定義為同一藥材似有不妥，對其進行系統(tǒng)對比研究很有必要，能達到正本清源，為標(biāo)準(zhǔn)制訂提供實驗依據(jù)的目的。

血清藥理學(xué)方法也存在諸多待解決的問題，如無確定的最佳給藥方案、最佳的采血時間，無法做到體外培養(yǎng)體系內(nèi)藥物濃度與血藥濃度相等而又不影響細胞生長等。這些都有可能對實驗結(jié)果造成影響，從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果[7]。但在同樣實驗條件下，兩種含藥血清所得的結(jié)果對于對比其藥理活性的不同是有參考價值的。

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