紅花中羥基紅花黃色素A的分離純化工藝Δ

唐 紅，董 志，曹緯國，肖曉秋，劉 媛，程玉潔，王樂樂（重慶醫(yī)科大學藥學院，重慶 400016）

紅花為菊科紅花屬植物紅花（Carthamus tinctoflus L）的干燥花，夏季花由黃變紅時采摘，陰干或曬干，產(chǎn)于河南、新疆、四川等地，具有祛瘀止痛的功效。藥理研究表明，紅花黃色素具有擴張冠脈、抗氧化、保護心肌、降血壓、免疫抑制和腦保護等255種藥理學功效。臨床上常用于冠心病、高血壓、心腦血管等疾病的預防和治療[1，2]，常以水煎液入藥。羥基紅花黃色素A（Hydroxysafflor Yellow A，HSYA）是一種查耳酮苷類物質，是紅花黃色素中含量較高的一種水溶性成分，具有藥理效應代表性，且為單體，無明顯的毒副作用，有著極好的新藥開發(fā)前景。筆者采用溫浸法對主要的活性物質進行提取、分離、純化，并對其最終含量進行測定[3～5]。

1 儀器與試藥

UV-3150 PS（E）紫外分光光度計（日本津島公司）；RE-52 AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵、DT-100 A型分析天平（北京光學儀器廠）；PYXHXZ電動振蕩器（廣東韶關科力實驗儀器有限公司）；GSY-Ⅱ不銹鋼電熱恒溫水浴鍋（北京市醫(yī)療設備廠）。

紅花購自重慶市藥材市場，經(jīng)重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院何先元副教授鑒定為菊科川紅花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花（貯藏于室溫的干燥器中）；HSYA對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111637-200905，純度：91.8%）；ZTCⅡ型天然澄清劑（含A、B組分，天津天成澄清劑有限公司）；D4020、D101、D3520、AB-8、ADS-17、X-5型大孔樹脂（天津南開大學化工廠）；聚酰胺薄膜、80～100目聚酰胺樹脂（浙江臺州四甲生化塑料廠）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結果

2.1 紅花粗提液的制備

稱取400 g紅花藥材，第1次提取加入藥材量12倍的超純水，70℃水溫浸泡30 min，第2次提取加入10倍量的超純水，70℃水溫浸泡20 min，合并2次提取液，按1∶2比例60℃減壓濃縮，加入濃縮后藥液體積6%的ZTCⅡ型澄清劑B組分（置于70℃水浴中），絮凝30 min，再加入3%ZTCⅡ型澄清劑A組分，絮凝60 min后抽濾除去沉淀，60℃減壓濃縮至提取液含生藥1 mg·mL－1，上柱備用。

2.2 大孔樹脂分離HSYA

2.2.1 樹脂的預處理 分別將D101、D4020、D3520、ADS-17、AB-8、X-5型大孔樹脂置于95%乙醇中浸泡24 h，濕法裝柱，用95%乙醇洗至取流出液1mL，加4mL超純水洗至無渾濁現(xiàn)象，再用超純水洗至無醇味，備用。

2.2.2 靜態(tài)吸附篩選最佳樹脂型號 稱取5.0 g預處理好的6種濕樹脂，分別加入到100mL帶塞錐型瓶中，每種樹脂稱3份，加入10 mL粗提液，置于28℃、120 r·min－1恒溫振蕩器上振蕩24 h，吸附平衡后，采用紫外-可見分光光度法（檢測波長：403 nm；回歸方程：Y＝42.585 X－0.0287（r＝0.9999））測定吸附后溶液中HSYA含量。根據(jù)下式計算不同型號大孔樹脂的靜態(tài)吸附量（Q，mg·g－1）、吸附率（%）：Q＝（ρ0ν0－ρeνe/m）×100%、吸附率＝（ρ0ν0－ρeνe/ρ0ν0）×100%（式中，ρ0為吸附前溶液中HSYA的總質量濃度；ν0為吸附前溶液總體積；ρe為吸附飽和后溶液中HSYA的總質量濃度；νe為吸附后溶液的總體積；m為樹脂質量）。結果，D101、D4020、D3520、ADS-17、AB-8、X-5型大孔樹脂的Q分別為0.3209、0.3256、0.2829、0.3147、0.3234、0.3325mg·g－1，吸附率分別為 91.8%、93.15%、81.95%、90.04%、92.55%、95.15%，X-5型大孔樹脂的Q和吸附率均較高，故選擇X-5型大孔樹脂。

2.2.3 靜態(tài)吸附篩選洗脫液濃度 將吸附液濾去，分別向達到吸附平衡的樹脂中加入30%、50%、70%的乙醇溶液（每組進行3次平行試驗），28℃下連續(xù)振搖12 h，測定此解吸液中HSYA的含量，按下式計算不同濃度的乙醇溶液的解吸附率（%）：解吸附率＝（ρdνd/ρoνo－ρeνe）×100%（式中，ρd為解吸液中的HSYA總質量濃度；νd為解吸液體積）。結果，乙醇濃度為50%時，平均解吸附率達到了98.21%，對HSYA的洗脫效果最佳。不同濃度乙醇對HSYA解吸附的影響見圖1。

圖1 不同濃度乙醇對HSYA解吸附的影響Fig 1 Effects of different concentration of ethonal on desorption of HSYA

2.2.4 靜態(tài)吸附篩選提取液的pH值 稱取6份質量為5 g的X-5型大孔樹脂，分別置于250 mL錐形瓶中，加入pH值分別為1、2、3、4、5、6的紅花粗提液（質量濃度為0.383 mg·mL－1）各20 mL，恒溫攪拌，每隔5 min振蕩30 s，持續(xù)2 h，然后靜置24 h，使其達到飽和吸附狀態(tài)。分別測定吸附后溶液中HSYA含量，計算不同pH值下的Q。結果，當pH值分別為1、2、3、4、5、6時，Q分別為0.3760、0.3762、0.3831、0.3795、0.3818、0.3796 mg·g－1，當pH值為3時的Q最大，故選擇提取液的pH值為3。

2.2.5 動態(tài)吸附篩選不同流速 量取4份10 mL經(jīng)過預處理的X-5型大孔樹脂，分別裝入內徑2 cm的層析柱，加入紅花粗提液5 mL，分別控制流速為1.0、1.5、2.0、2.5 mL·min－1，分段收集流出液，測定流出液中HSYA含量，并計算吸附率和解吸附率。結果，流速控制在1mL·min－1時吸附率和解吸附率最佳。不同流速對HSYA吸附和解吸附的影響見圖2。

2.2.6 動態(tài)吸附篩選不同徑高比 將紅花粗提液上X-5型大孔樹脂層析柱（2 cm×40 cm），上樣量固定為柱體積的2%，流速為1 mL·min－1，徑高比分別為1∶8、1∶10、1∶12，1∶15，測定HSYA的吸附率和解吸附率。結果，徑高比分別為1∶8、1∶10、1∶12、1∶15時的吸附率分別為93.3%、94.1%、94.8%、95.2%，解吸附率分別為89.7%、88.9%、93.6%、90.3%，表明徑高比為1∶12時的分離效果較好。

圖2 不同流速對HSYA吸附和解吸附的影響Fig 2 Effects of different flow rates on adsorption and desorption of HSYA

2.2.7 動態(tài)吸附篩選上樣量 將紅花粗提液上X-5型大孔樹脂（2 cm×40 cm）層析柱，徑高比為1∶12，流速為1 mL·min－1，上樣液pH值為3，分別以1%、2%、3%、4%柱體積上樣，測定HSYA的吸附率和解吸附率。結果，上樣量分別為1%、2%、3%、4%柱體積時，吸附率分別為94.6%、95.3%、90.4%、91.2%，解吸附率分別為88.6%、92.8%、91.3%、89.7%，表明上樣量為2%時分離效果最佳。

2.2.8 大孔樹脂分離HSYA的工藝 將濃縮得到已知濃度的紅花粗提液上X-5型大孔吸附樹脂，采用2%柱體積紅花粗提液上樣，徑高比為1∶12，洗脫速度為1 mL·min－1，先用150 mL超純水洗脫，待流出液Molish反應呈陰性時以400 mL50%乙醇洗脫，分段接取洗脫液，以HSYA為對照品進行聚酰胺薄膜法檢視，點樣后以乙酸乙酯-甲醇-3.6%鹽酸（1∶3∶6）為展開劑展開，在紫外光燈（254 nm）下檢視。當洗脫液在HSYA對照品熒光斑點對應處無斑點顯示時，表明HSYA成分基本洗脫完全，收集含HSYA成分的洗脫液，備用。

2.3 聚酰胺樹脂法純化HSYA

采用聚酰胺樹脂對HSYA進行動態(tài)吸附，按“2.2”項下方法篩選得到聚酰胺樹脂純化HSYA工藝為徑高比1∶14，上樣量為2%柱體積，流速為1.5 mL·min－1，洗脫溶劑為乙酸乙酯-甲醇-3.6%鹽酸（1∶3∶6），反復上柱6次。直至樣品的主斑點與HSYA對照品的Rf值一致，基本無雜質斑點即可。干燥后的粉末采用紫外-可見分光光度法測定HSYA含量為83.65%。

3 討論

本研究通過靜態(tài)吸附試驗考查了不同極性、比表面積和孔徑大小的6種大孔樹脂對HSYA的吸附和解吸附效果的影響[6]，篩選出了對HSYA吸附-解吸附效果較好的X-5型大孔樹脂。非極性的X-5型大孔樹脂對HSYA的吸附可逆性好，回收率高；而非極性的D3520、D4020和ADS-17型大孔樹脂由于極性低，比表面積和平均直徑較小導致其對HSYA的吸附量較小；弱極性AB-8型大孔樹脂對HSYA吸附作用力強，解吸較低，不適用于對HSYA的分離及樹脂的重復利用，并增加生產(chǎn)成本。因此，最終選擇X-5型大孔樹脂對HSYA進行分離。

ZTCⅡ型澄清劑分為A、B兩組分，它是以天然多糖等為原料制成的食品添加劑，安全無毒，澄清對象為蛋白質、鞣質、蠟質等[7]。本試驗結果顯示：該澄清劑使用方便，有效成分損失小。大孔樹脂是一類有機高聚物吸附劑，是一種非凝膠型，注有致孔劑，不含交換基團，含有“空隙”結構的聚合物，特別適合從水溶液中分離化合物。將澄清劑法與大孔樹脂法結合，能夠降低成本，提高除雜效率。通過對影響大孔樹脂吸附與解吸附的各種因素的系統(tǒng)研究，最后選定了最佳分離、純化工藝，在此條件下得到HSYA的產(chǎn)率為25.63%，純度為83.65%。

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