離子液體［Bmim］Cl對釀酒酵母AY92022生長的影響

陳 瑞，王偉強

（1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽 六安237012；2.皖西學院 安徽省植物生物技術實驗實訓中心，安徽 六安237012）

室溫離子液體［1-2］是指一類室溫或相近溫度下完全由離子組成的有機液體化合物，簡稱離子液體，也稱室溫熔融鹽。

有研究發現：用離子液體［Bmim］Cl預處理纖維素，將經離子液體預處理過的纖維素和纖維素酶混合后，加入到醋酸—醋酸鈉緩沖液中，60℃下進行糖化。隨著預處理溫度的升高，平均糖化速度呈現先增大后減小的變化，90℃時達到最大，比未處理的提高了近70%。纖維素的聚合度［3］隨預處理溫度的變化與平均糖化速度的變化規律相一致。比較經離子液體處理前后纖維素的表觀結構，發現纖維素出現了明顯的斷裂，聚合度下降。纖維素酶分子通常由催化結構域、纖維結合結構域及二者的連接區所組成，纖維素酶分子的結合結構域通過芳香族氨基酸上的芳香環和葡萄糖環的堆積力吸附到纖維素上，再由纖維結合結構上其余氫鍵形成的殘基與相鄰纖維素鏈形成的氫鍵將單個纖維素鏈從纖維素聚集體表面疏解下來，然后催化域從纖維素鏈的末端作用，產生葡萄糖或纖維二糖［4］。聚合度的下降減少了纖維素的結晶區，增加了纖維素酶催化域的作用位點，因而提高了酶解糖化的效率。盡管離子液體［Bmim］Cl可以改變纖維素的空間結構［5］，提高其糖化效率，但離子液體的毒性目前依然研究較少。離子液體［Bmim］Cl對釀酒酵母的生長和發酵是否有影響，影響程度如何，未見相關報道。因此，本實驗在適宜的溫度下，研究發酵液中各種物質的變化，初步探討離子液體［Bmim］Cl對釀酒酵母生長和發酵［6］的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌種：釀酒酵母AY92022（Saccharomyces cerevisiae AY92022）

試劑：離子液體［Bmim］Cl購于河南利華制藥，酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、氯化鉀、硫酸、蒽酮、葡萄糖等試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌AY92022的培養

配制5組液態PDA培養基，其中1組作為對照組，不加［Bmim］Cl，其余4份加入不同質量的［Bmim］Cl，使［Bmim］Cl濃度分別為10-3g／g，10-4g／g，10-5g／g，10-6g／g。將釀酒酵母AY92022接種到100mL的液態PDA培養基中，28℃、200r／min，培養48h。

1.2.2 酵母菌數量的測定

采用分光光度計法測菌體濃度［7］。

1.2.3 還原糖含量的測定

采用蒽酮比色法［8］。

1.2.4 乙醇含量的測定

采用重鉻酸鉀比色法［9］。

2 結果與分析

2.1 菌體生長情況

［Bmim］Cl對釀酒酵母AY92022生長的影響見圖1。

圖1 ［Bmim］Cl對釀酒酵母生長的影響

其中-3，-4，-5，-6分別代表發酵液中離子液體濃度為：10-3g／L，10-4g／L，10-5g／L，10-6g／L，對照組的發酵液中不含有離子液體［Bmim］Cl。

從圖1可以看出：與對照組一樣，釀酒酵母AY92022在接種后4h內菌體濃度無變化，但很快進入對數生長期，24h左右進入穩定生長期，菌體濃度不再增加。當［Bmim］Cl的濃度小于10-6g／L時，離子液體對菌體生長的影響不大。隨著［Bmim］Cl濃度的逐漸增大，菌體的數量減少。當［Bmim］Cl的濃度達到10-5g／L，酵母菌的生長受到明顯影響，當［Bmim］Cl的濃度達到10-3g／L時，穩定期菌體濃度為0.0101g／mL，為對照組的63.5%，經過進一步單因素方差分析，離子液體對釀酒酵母AY92022的生長有明顯的抑制作用（P＜0.05）。最后，酵母菌進入衰退期，菌體濃度下降。

2.2 葡萄糖含量變化情況

［Bmim］Cl對釀酒酵母AY92022分解葡萄糖的影響見圖2。

圖2 ［Bmim］Cl對釀酒酵母分解葡萄糖的影響

其中-3，-4，-5，-6分別代表發酵液中離子液體濃度為：10-3g／L，10-4g／L，10-5g／L，10-6g／L，對照組的發酵液中不含有離子液體［Bmim］Cl。

由圖2可以看出：前4h，酵母菌在延滯期，發酵液內葡萄糖含量變化不大。在8h至24h，隨著酵母菌進入生長期，葡萄糖的代謝量增加，其中對照組菌體增加最快，葡萄糖的代謝也最快。24h后，酵母菌進入穩定生長期，雖然菌體濃度不再增加，但對葡萄糖依然有較大的需求量。隨著［Bmim］Cl濃度的逐漸增大，發酵液中葡萄糖的代謝量減少。當［Bmim］Cl的濃度達到10-5g／L，葡萄糖的代謝受到明顯影響，當［Bmim］Cl的濃度達到10-3g／L時，葡萄糖的代謝受到的影響最大，濃度為1.59%，為對照組的2.41倍，經過進一步單因素方差分析，離子液體對釀酒酵母AY92022的生長有明顯的抑制作用（P＜0.05）。

2.3 乙醇含量變化情況

［Bmim］Cl對釀酒酵母AY92022產乙醇的影響見圖3。

圖3 ［Bmim］Cl對釀酒酵母產乙醇的影響

其中-3，-4，-5，-6分別代表發酵液中離子液體濃度為：10-3g／L，10-4g／L，10-5g／L，10-6g／L，對照組的發酵液中不含有離子液體［Bmim］Cl。

由圖3可以看出：前24h，菌體處于延滯期和對數生長期，葡萄糖的消耗主要用于酵母菌的生長，發酵液內乙醇含量變化不大。24h后，酵母菌進入穩定期，菌體菌濃度達到最大，酵母菌開始代謝產生乙醇。隨著葡萄糖的進一步消耗，乙醇的含量快速增加，到48h時，菌體進入衰退期，菌體濃度開始下降，乙醇含量不再增加。同樣，當離子液體［Bmim］Cl的濃度比較小時，發酵液中乙醇含量變化的不大，當［Bmim］Cl的濃度達到10-5g／L，此時發酵液內的乙醇產量受到明顯影響，當［Bmim］Cl的濃度達到10-3g／L時，發酵液內乙 醇濃度為4.83g／L，為對照 組 的61.4%，經過進一步單因素方差分析，離子液體對釀酒酵母AY92022的生長有明顯的抑制作用（P＜0.05）。

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