基于Plackett-Burman設計的刺糖多孢菌培養條件優化

沈秀軍，劉 柳，高 亮，黃訓端

（安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥230601）

多殺菌素是新型生物源農藥，殺蟲效果高度專一，能有效地控制鱗翅目、雙翅目、纓翅目、鞘翅目和直翅目等作物害蟲，對昆蟲天敵、哺乳動物和水生生物低毒或無毒，可光降解或微生物分解，環境友好［1-7］。多殺菌素類農藥通過美國環保局的注冊和農業部有機農業使用認證準許，獲得了美國“總統綠色化學品挑戰獎”［1］。目前，世界上已有多個國家批準使用該類農藥，我國多殺菌素類產品主要依賴進口。

刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）是多殺菌素的生產菌。為加快多殺菌素的開發利用，科技人員主要做了兩方面工作：第一是刺糖多孢菌菌株選育，主要側重于多殺菌素的高產性、穩定性等方面［8］；第二是刺糖多孢菌生長特性及發酵技術研究，優化與研究刺糖多孢菌培養條件，是提高發酵水平的重要途徑。國內外學者相繼開展了大量發酵研究工作［9-11］，但刺糖多孢菌為好氧生物，培養過程復雜，影響因素多，條件參數可重復性差，需進一步優化處理。

實驗優化方法較多，Plackett-Burman設計是最具優勢的方法之一。Plackett-Burman設計針對因子數較多、不能判定各個因子作用情況下，選取若干影響因子，通過分析各因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性，為優化實驗提供依據。Plackett-Burman設計高效、實用，已廣泛應用于生物學過程研究中［12-13］。本研究通過Plackett-Burman設計，優化刺糖多孢菌培養條件，為進一步提高多殺菌素產量奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

刺糖多孢菌，本實驗室保藏菌種。

1.2 儀器設備

全溫培養搖床，上海新苗醫療器械制造有限公司；超凈工作臺（SCV-4A1），新加坡ESCO公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；離心機；電子分析天平。

1.3 培養基

種子 培 養 基 （g／L）：可 溶 淀 粉 20.0，葡 萄 糖10.0，牛肉膏蛋白胨30.0，酵母提取物3.0，MgSO4·7H2O 2.0，KH2PO41.0。發酵培養基（g／L）：葡萄糖40.0，牛肉膏蛋白胨 15.0，NaCl 3.0，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 2.0。以上培養基配好后，于121℃濕熱滅菌30min，備用。

1.4 培養方法

種子培養方法：將刺糖多孢菌從斜面取適量接種到種子培養基中，30℃條件下，搖床轉速240r／min培養至一定菌液濃度，備用。搖瓶發酵培養方法：在裝有培養基的250mL三角瓶中，按一定比例接種菌種，在一定溫度條件下振蕩培養一定時間，測定其生物量。

1.5 生物量測定

采用菌體干重測定法。取10mL培養液于離心管中，3 500r／min離心15min，棄去上清液，將菌體置于105℃下干燥至恒重，稱量計算刺糖多孢菌生物量。

1.6 實驗設計方法

1.6.1 單因素實驗

刺糖多孢菌發酵實驗在250mL三角瓶中進行，由于影響微生物生長因素很多，在前期研究的基礎上，選擇培養基初始pH值、接種量、玻璃珠數、溫度、裝液量、轉速、時間等7個因素，考查各因素對生物量的影響。各種因子設置梯度為：初始pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；接種量0.5%、1%、2%、3%、4%；玻璃珠個數1個、5個、10個、15個、20個；溫度24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃；裝液量20 mL、30mL、40mL、50mL；轉速160r／min、200r／min、240r／min、280r／min、320r／min；時間為36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144 h、156h、168h。

1.6.2 Plackett-Burman實驗設計

對初始pH值、接種量、玻璃珠數、培養溫度、裝液量、轉速、時間等7因子分別編碼（表1），為滿足實驗誤差分析需要，設置4個因子虛擬項，每個因子設置2個水平，高水平賦值為1，低水平賦-1，實驗以刺糖多孢菌生物量為響應值（Y），采用 Design Expert軟件進行實驗設計（表2），共12組實驗。

表1 實驗因素水平及編碼代碼

1.7 數據處理

以Design Expert（version 8.0.7.1）為工具，進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 培養基初始pH值對刺糖多孢菌生物量的影響

每種微生物有其適宜的pH范圍，培養基初始pH值是接種后微生物生長繁殖的重要環境因子，影響微生物的生物量。刺糖多孢菌的生長與初始pH值關系見圖1。從圖1顯示刺糖多孢菌在初始pH值6.5～7.5的范圍內能較好生長，在初始pH值為7時，生物量最大，達到8.23g／L。

圖1 初始pH值與刺糖多孢菌生物量的關系

2.2 接種量對刺糖多孢菌生物量的影響

將刺糖多孢菌在種子培養基中培養至菌液濃度為1×108CFU／mL，按比例接入發酵培養基，接種量對多殺菌素生產菌生物量的產生了影響（圖2），隨接種量的增加，生物量呈遞增趨勢，但隨著接種量的進一步增大，生物量下降。接種量大小與菌株在發酵過程中的生長繁殖速度有關。但是過大的接種量往往使菌體生長過快、過稠，造成營養基質缺乏或溶解氧不足而不利于發酵；接種量過小，則會引起發酵前期菌體生長緩慢，使發酵周期延長，還可能產生菌絲團，導致發酵異常等。圖2表明，接種量在1%～4%之間較為適宜，以2%為最佳。

圖2 接種量與刺糖多孢菌生物量的關系

2.3 添加玻璃珠個數對刺糖多孢菌生物量的影響

在培養基中添加玻璃珠，具有維持液體培養基溶氧和分散菌體的作用。由圖3可知，在250mL三角瓶中，玻璃珠數量在5～20個范圍內較為合適，其中以15個最佳，玻璃珠數量過多時，雖然溶氧條件改善，但液體的剪切力最加，有可能引起菌體損傷，或細胞死亡。

圖3 添加玻璃珠數量與刺糖多孢菌生物量的關系

2.4 溫度對對刺糖多孢菌生物量的影響

培養溫度是微生物生長繁殖的關鍵環境因子。圖4表明刺糖多孢菌生物量與培養溫度呈先增后降的變化規律。當培養溫度小于30℃時，溫度與生物量呈同向遞增的關系；大于30℃，溫度與生物量呈反向遞減關系。刺糖多孢菌的最適宜溫度為30℃。

圖4 培養溫度與刺糖多孢菌生物量的關系

2.5 搖瓶裝液量對刺糖多孢菌生物量的影響

搖瓶裝液量與微生物生長中需氧量、微生物分散度都有一定關系。在250mL三角瓶中，搖瓶裝液量對多殺菌素生產菌生物量的影響見圖5。從圖5可以看出，30mL時生物量最大，當裝液量大于30時，隨著裝液量的增加，發酵單位呈顯著下降趨勢。

圖5 搖瓶裝液量與刺糖多孢菌生物量的關系

2.6 搖瓶轉速對刺糖多孢菌生物量的影響

振蕩培養也與液態培養基溶氧、菌體分散、振蕩剪切力有關。在250mL三角瓶中，考查了轉速范圍160～320r／min，對多殺菌素生產菌生物量的影響（圖6）。結果表明在200～320r／min轉速條件下，生長良好，其中以240r／min最佳。

圖6 搖瓶轉速與刺糖多孢菌生物量的關系

2.7 培養時間對刺糖多孢菌生物量的影響

培養時間與刺糖多孢菌生物量關系密切（圖7），在培養時間72～156h范圍內菌體生物量較大，其中培養時間96～120h生物量最大。圖7也反映了該菌的生長特性，培養時間在36～84h時處于對數期，生長迅速；84～144h時處于穩定期；144h以后進入衰亡期。

圖7 培養時間與多殺菌素生產菌生物量的關系

2.8 刺糖多孢菌培養條件Plackett-Burman分析與優化

根據Plackett-Burman設計要求，開展了12組實驗，通過搖瓶實驗、生物量的測量，獲得了實驗響應值Y，實驗設計及結果見表2。從響應值來看，刺糖多孢菌生物量范圍從5.90g／L到8.98g／L，不同實驗條件下，響應值存在差異。

在Design Expert軟件輔助下，對Plackett-Burman實驗結果進行分析，回歸模型方差分析見表3。表3表明，回歸模型的P值小于0.01，模型極顯著，模型的決定系數R2為0.9767，調整決定系數R2為0.9359，說明回歸模型可以解釋93.59%的響應值變化，模型的擬合度高。系數顯著檢驗結果顯示，初始pH 值（x1）、培養溫度（x5）、裝液量（x7）、轉速（x8），達到極顯著或顯著水平。

表2 Plackett-Burman實驗設計與結果

表3 回歸模型方差分析表

回歸系數估計及因子貢獻率見表4。在本實驗設計條件下，7個因子的重要性排序為：初始pH值、培養溫度、搖瓶轉速、搖瓶裝液量、玻璃珠數、接種量、時間。從貢獻度來分析，前4個因子對響應值的影響貢獻率總和達90.8%，其中初始pH值貢獻率為55.23%、培養溫度為24.45%，兩者為重中之重。由此，可以確定初始pH值、培養溫度、搖瓶轉速、搖瓶裝液量為刺糖多孢菌發酵條件的注效因子。

根據表4，建立回歸方程：Y＝7.73-0.63x1-0.14x2＋0.17x4＋0.42x5-0.20x7＋0.20x8＋0.021x10。為重點考慮主效因子的作用，將回歸模型修正 為：Y ＝7.73-0.63x1＋0.42x5-0.20x7＋0.20x8。利用該模型，預測刺糖多孢菌的最大生物量可達9.18g／L。

表4 回歸系數估計及因子貢獻率分析

3 結論

在單因子實驗基礎上，通過Plackett-Burman實驗設計，建立刺糖多孢菌生物量回歸模型：Y＝7.73-0.63x1＋0.42x5-0.20x7＋0.20x8，模型顯著，快速篩選出初始pH值、培養溫度、搖瓶轉速、搖瓶裝液量為顯著性影響因子，4因子對響應值變化的影響達90.8%，為進一步開發刺糖多孢菌發酵技術提供了參考。

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