放射線照射引起膠質瘤細胞細胞周期和凋亡的動力學變化及其對Chk1/2蛋白表達的影響

李勇 賴潤龍 陳煜 譚殿輝 雷霆

放療在膠質瘤臨床治療中占有舉足輕重的地位，放療的療效好壞很大程度上取決于DNA損傷檢測點的功能狀態。目前國外研究多采用同步化處理的腫瘤細胞來建立G2/M阻滯模型[1]，本研究采用更能真實反映細胞內在生物學特性的非同步化的腫瘤細胞，研究放療作用下，膠質瘤細胞的細胞周期和凋亡的內在動力學變化并討論放射線損傷對Chk1和Chk2蛋白表達的影響，以了解膠質瘤細胞中Chk1和Chk2對照射后細胞周期的調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系培養及照射 本課題采用人膠質母細胞瘤U251細胞株，由武漢大學典型物保藏中心提供。在37 ℃恒溫培養箱內對U251細胞進行復蘇、培養至對數生長期，再進行傳代。將5×105細胞接種于6孔板中，室溫下采用瑞典Elekta公司SLi型直線加速器，250 Gy/min 6 MV X線照射分別給予6 、10 、15 Gy三種劑量的照射。于6、12、24、48、60 h收獲細胞和上清，800 r/min離心5 min，加入75%冰乙醇1 ml固定，-20 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率(PI法) 取出固定的細胞，制成單細胞懸液，離心洗滌后加入75%的冰乙醇1 ml固定過夜。再次洗滌離心后加入500 μl染液(240 μl PBS、10 μl RNase(1 mg/ml)、250 μl碘化丙錠(50 μg/ml)(propidium iodide，PI))，室溫避光孵育 20 min，流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡率。

1.2.2 Western blot法檢測Chk1、Chk2蛋白表達量 收集的U251細胞，裂解后離心，將上清轉管后于-80 ℃凍存，采用Bradford方法測定Chk1/2蛋白質濃度。收集的蛋白質樣本采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分別檢測Chk1/2蛋白及磷酸化的Chk1-S345及Chk2-T68蛋白的表達量。

1.3 統計學處理 統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 U251細胞株細胞周期和凋亡的動力學特點 人膠質瘤細胞系U251經過6 Gy的射線照射后，引起的G2/M期阻滯較弱，當劑量增加至10 Gy，照射24 h后引起非常顯著的G2/M期阻滯，達77.35%，并在一定范圍內呈現明顯的時間依賴效應和劑量依賴效應(見圖1)。

隨著時間延長(24 h后)，阻滯于G2/M期的細胞開始釋放，一部分細胞繼續進入細胞周期，而另一部分細胞走向凋亡，表現為細胞凋亡明顯增加(見圖2)。而當劑量增加至15 Gy時，沒有出現明顯的細胞周期阻滯現象，而直接表現為凋亡的增加。

圖1 U251細胞照射后細胞周期阻滯趨勢示意圖

圖2 U251細胞照射后細胞凋亡趨勢示意圖

2.2 Western blot法檢測U251細胞照射后Chk1和Chk2蛋白的表達 接受不同劑量射線照射后，U251細胞中Chk1、Chk2蛋白表達水平與未照射相比均無明顯變化。采用磷酸化抗體檢測發現，照射前后Chk1-S345無明顯磷酸化；但照射后6 h，Chk2-T68即出現明顯的磷酸化，12 h達到峰值，24 h后Chk2-T68磷酸化水平開始下降，至60 h Chk2-T68磷酸化水平已基本趨于正常，但Chk2-T68磷酸化水平與照射劑量無關，6 Gy與10 Gy照射后相同時間點Chk2-T68磷酸化水平無明顯差別(P>0.05)。見圖3。

圖3 Western blot法檢測照射后Chk1/2蛋白表達

3 討論

在長期進化過程中，機體形成了一套防止DNA發生損傷/錯誤的細胞周期監控機制，使機體遺傳信息能夠準確無誤地傳遞到子細胞，這一套監控機制統稱為DNA損傷檢測點。在放療條件下，DNA損傷檢測點的激活，有利于腫瘤細胞DNA損傷/錯誤的修復，客觀上為細胞的生存提供了條件，本質上是一種細胞的自我保護程序[2]。

本研究發現，U251細胞株在正常培養條件下主要處于G1/G0期，這與體外培養的其他哺乳動物細胞生長特性相似[3]。對膠質瘤U251細胞株進行射線照射處理后建立了U251細胞G2/M期的細胞周期阻滯模型，發現10 Gy射線照射24 h后引起非常顯著的G2/M期阻滯，并在一定范圍內呈現明顯的時間依賴效應和劑量依賴效應。隨著時間延長(24 h后)，阻滯于G2/M期的細胞開始釋放，一部分細胞繼續進入細胞周期，而另一部分細胞走向凋亡，表現為細胞凋亡明顯增加。目前研究發現，照射所致的G2/M期阻滯比G1期阻滯更為普遍，大部分腫瘤細胞在接受照射后表現為G2/M期阻滯，而僅有p53(＋)和Rb(＋)表型的細胞接受照射后產生G1期阻滯，因為只有p53和Rb正常，且有p21參與時，細胞受到照射時才產生G1/S期阻滯，而大部分腫瘤細胞存在p53或Rb異常，因而喪失了G1/S期檢測點的功能，僅保留了G2/M期檢測點的功能，成為腫瘤細胞在損傷刺激下出現的自我保護機制的最后一道屏障[4]。

由于正常終末細胞的細胞周期基本處于停滯狀態，大多數細胞均處于G1期，當其接受照射后依然表現周期停滯狀態，無G2/M期阻滯表現，因此，封閉正常細胞的Chk1，Chk2其效果將較腫瘤細胞為差，因為Chkl和Chk2主要參與G2/M期阻滯，所以，封閉Chk1，Chk2本身就有腫瘤特異性，具有較強的靶向性，這將有利于擴大腫瘤治療的治療窗，提高治療效果[5]。

研究還發現，U251細胞接受不同劑量的照射處理后，引起細胞周期阻滯的程度有一定的差異，在6 Gy的射線作用下，僅引起較輕微的G2/M期阻滯；在10 Gy射線作用24 h后，G2/M期阻滯達77.35%；當照射劑量增加至15 Gy時，則沒有明顯的細胞周期阻滯現象，而直接表現為凋亡的增加。這是因為當損傷較小或有望修復時，細胞通過一系列調節機制抑制細胞周期的進行，抑制DNA的復制，阻止細胞的分裂，為DNA修復系統提供充足的時間進行DNA修復，若修復成功，細胞繼續進行或完成下一個細胞周期事件，若不能修復，細胞則發生凋亡[3]。同時，在觀察U251細胞周期和凋亡的動力學變化中發現，細胞周期阻滯的程度在一定范圍內表現為照射劑量依賴性增強，而細胞凋亡均發生于細胞周期阻滯解除后，其強度與細胞周期激活的程度成反比。

本研究發現，在接受不同劑量射線照射后U251細胞中Chk1和Chk2蛋白表達并不受影響，這與以往文獻報道結果相一致[6]。Chk1和Chk2激酶主要在磷酸化激活后發揮作用，Chk1激酶第345位絲氨酸是其激酶激活的重要磷酸化位點[7]。本研究發現，射線照射后并不影響U251細胞中Chk1-S345的磷酸化，原因在于Chk1-S345主要由藥物作用后被磷酸化，但Chk1激酶對照射后細胞周期檢測的點功能維持也非常重要。照射后主要以Chk2激酶磷酸化激活為主，Chk2激酶第68位蘇氨酸磷酸化在Chk2激酶激活中極為關鍵[8]，Chk2-T68被磷酸化后，繼而引起Chk2自動磷酸化和激酶激活。照射后只影響Chk2-T68的磷酸化水平，不影響Chk1、Chk2蛋白水平的表達，磷酸化水平高低與照射劑量無明顯關系。

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