酒醅發酵過程中氨基甲酸乙酯與尿素的變化

范文來，徐 巖，史斌斌

(教育部工業生物技術重點實驗室，江南大學生物工程學院，釀造微生物與應用酶學研究室，江蘇無錫214122)

氨基甲酸乙酯(EC，ethyl carbamate)天然存在于發酵食品中［1］，1943 年發現 EC 具有致癌性［2］。早期，世界衛生組織國際癌癥研究把EC歸為一種可能對人類致癌的物質(2B類)。2007年3月，該機構經過重新分類，已把EC歸為2A類致癌物［3－4］。大量文獻報道了EC的基因毒性和致癌性，但飲料酒中EC的檢測到1985年才引起關注，加拿大官方發現多種飲料酒中EC的含量很高。當年，加拿大設定了飲料酒中EC最高允許濃度，規定佐餐葡萄酒、加強葡萄酒(fortified wine)、蒸餾酒(distilled spirits)、清酒(sake)和水果白蘭地(fruit brandy)中EC含量分別不得超過 30、100、150、200、400μg/L［5］。研究表明，飲料酒中EC由尿素或氰化物與乙醇反應產生［5］，主要形成于發酵、加熱或蒸餾以及儲存過程［6］。尿素公認為是葡萄酒中EC最主要的前體物［5］，在葡萄酒儲存過程中EC會繼續產生，且隨溫度的升高生成速度加快［7］，通常控制低于24℃貯存溫度避免大量EC的形成［8］。氰化物是威士忌與白蘭地酒中EC的前驅物［9］。飲料酒中EC濃度最高的是石果白蘭地(stone－fruit brandy)，最高達 22mg/L［5］。我國黃酒中 EC的研究較早［10－11］，白酒中EC的研究是近幾年才開始的，通常采用氣相色譜－質譜法(GC－MS)［12－14］、二維氣相色譜法(MDGC)［15］、頂空固相微萃取(HSSPME)結合 GC－MS［16－17］檢測白酒中的 EC，但沒有發現發酵過程中固態發酵基質大曲與酒醅檢測方法的研究報道。為深入研究白酒發酵過程中EC及其前驅物尿素的變化規律，本研究采用超聲萃取處理白酒大曲和酒醅，HS－SPME方法來定量分析白酒大曲和酒醅中EC的含量。通過對白酒大曲和酒醅進行定量分析，確定EC的演化規律;同時對白酒大曲和酒醅中的尿素進行檢測，確定EC與尿素之間的相互關系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

內標氨基甲酸丙酯(PC) 上海安譜科學儀器有限公司;氯化鈉、磷酸、硫酸、尿素、硫代氨基脲、二乙酰一肟 中國醫藥集團上海化學試劑公司;實驗專用水 超純水(Milli－Q 系統，Millipore，Badford，MA，USA);白酒大曲和酒醅 由相應白酒廠提供。

氣相色譜質譜聯用儀(GC 6890N－MSD 5975)美國Agilent公司;固相微萃取自動進樣器(MPS2)德國Gerstel公司;固相微萃取頭PA Supelco公司;分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制 二乙酰一肟(DAM)溶液，濃度2.5×104mg/L，4℃冰箱保存。硫代氨基脲(TSC)溶液，濃度2.5×103mg/L，4℃冰箱保存。酸試劑:準確量取300mL濃磷酸與10mL濃硫酸混合，分別倒入500mL容量瓶中，邊倒邊用自來水冷卻，最后用水定容至液面保持不變。顯色劑:按比例DAM溶液∶TSC溶液∶酸試劑 =2.5∶1∶50(V/V/V)混合三種溶液，搖勻后備用。顯色劑現配現用。尿素溶液(25mg/L):配濃度較大的母液作為儲藏液，稀釋得到梯度濃度標準溶液。

1.2.2 EC檢測樣品預處理 白酒大曲和酒醅的預處理(超聲萃取):稱量10g大曲(或者酒醅)，添加1%CaCl2(酒醅不添加)，用30mL(酒醅添加20mL)水作為浸提劑，浸泡30min，超聲30min(功率60W，超聲頻率40kHz)。然后在8000r/min于4℃下離心10min，收集上清浸提液。頂空固相微萃取(HSSPME):取8mL的上清浸提液到20mL的頂空瓶中，加入5μL內標PC，加入3g氯化鈉。插入萃取頭，預熱后萃取吸附，然后250℃下解吸5min。

1.2.3 GC－MS方法 GC條件:進樣口溫度250℃，載氣He，流速2mL/min，不分流進樣，色譜柱為DBFFAP(60m ×0.25mm ×0.25μm，J＆W Scientific)。升溫程序為:50℃恒溫2min，以5℃/min的速度升溫至170℃，再以 10℃/min的速度升溫至 230℃，保持5min。MS條件:EI電離源，電子能量70eV，離子源溫度230℃，掃描范圍35.00～350.00amu。MS檢測器采用SIM模式，特征離子m/z 62用于EC和內標PC兩種物質的定量。質譜分析用數據庫NIST05a1L。

1.2.4 EC標準曲線繪制 取超純水8mL，添加梯度濃度的EC標準品，再加入內標溶液，HS－SPME以及GC－MS檢測，制作標準曲線。利用內標標準曲線法，以待測物EC峰面積與內標PC峰面積之比為橫坐標(x)，待測物EC濃度與內標PC濃度之比值為縱坐標(y)，線性回歸，對目標化合物進行定量。

1.2.5 尿素分光光度計測定 參照文獻方法［18］，以超純水作為空白，在比色管中加入待測樣品1mL，再加入15mL顯色劑，定容到25mL，充分搖勻，于沸水浴(電磁爐燒水)中加熱26min，取出于流動的自來水中冷卻14min，再于室溫下分光光度計比色，波長527nm，光程1cm。

1.2.6 尿素標準曲線繪制 準備7只25mL比色管，依次加入 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3mL 的 25mg/L 尿素溶液，各管再分別加入15mL顯色劑，全部定容至25mL，充分搖勻，于沸水浴中加熱26min，取出于流動的自來水中冷卻14min。迅速取出于室溫下分光光度計比色，波長527nm，光程1cm。

以尿素含量為縱坐標，比色結果OD值為橫坐標，作尿素－吸光度標準曲線。

2 結果與討論

2.1 EC檢測方法評價

將一系列不同濃度的標準溶液置于優化好的萃取條件下(萃取溫度70℃，萃取時間45min)，加入內標進行標準曲線的繪制，結果詳見表1。

表1 酒醅和大曲中EC定量方法的線性及檢測限Table 1 Linearity and limit of detection of EC detected in fermented grains and daqu

從表1可以看出，該方法可以檢測的EC下限達7.8μg/L，檢測上限達 600μg/L，線性范圍寬;線性關系良好(R2＞0.99)。由表2可知，準確度(平均RSD 7.51%)、回收率(平均118%)較好。以信噪比等于3為標準，EC的檢測限(LOD)1.16μg/L，該方法可用于大曲和酒醅中EC的檢測。

表2 酒醅和大曲中EC定量方法的準確度和回收率(n=3)Table 2 Recovery and precision of EC detected in fermented grains and daqu

2.2 尿素檢測標準曲線

采用1.2.6的步驟制備標準曲線，得到的標準曲線如表3，可知在0～60mg/L的線性范圍內，該方法的線性關系很好(R2＞0.99)。

表3 酒醅和大曲中尿素定量方法線性Table 3 Linearity of urea detectedin fermented grains and daqu

2.3 白酒成品大曲中EC和尿素

對不同類型的大曲進行了分析，結果如表4。

由表4可以看出，不同類型大曲中尿素含量相差比較大。高溫曲(發酵溫度58～60℃)的三個樣品中尿素含量比較低，平均含量243.24mg/kg，超高溫曲(發酵溫度 65～70℃)和中溫曲(發酵溫度55～56℃)中尿素的含量則比較高，平均含量分別為512.57mg/kg和475.74mg/kg。這一現象與EC的含量變化類似，即超高溫曲與中溫曲EC含量高，而高溫曲EC濃度較低。

2.4 白酒酒醅中EC和尿素變化

表4 不同類型大曲中EC和尿素含量Table 4 Concentration of EC and urea in different type of Daqu

圖1 清香型大與二酒醅發酵過程中尿素與EC變化Fig.1 Changes of urea and EC of fermented grains of light aroma type liquor in the fermentation

2.4.3 兼香型酒醅發酵過程中EC與尿素的變化兼香型酒醅在發酵過程中開始時尿素含量上升，發酵至30d，尿素含量達最大(88.01mg/kg)，然后開始下降，至發酵終了時，尿素濃度下降到79.45mg/kg(見圖2)。EC的變化與尿素的變化同步，發酵至30d時，EC達最大值(130.69μg/kg)，然后開始下降，至發酵終了時，EC濃度降至122.89μg/kg。

表5 濃香型大酒醅中尿素與EC變化Table 5 Changes of urea and ECin fermented grain of strong aroma type liquor

表5 濃香型大酒醅中尿素與EC變化Table 5 Changes of urea and ECin fermented grain of strong aroma type liquor

注:0、2d是指濃香型酒醅堆積的天數，25、30、60d是指發酵時間。

0 2 25 30 60尿素(mg/kg)發酵時間(d)33.70 24.02 32.21 26.63 28.12 EC(μg/kg)＜q.l. ＜q.l. 167.99 149.18 112.12

圖2 兼香型酒醅發酵過程中尿素與EC變化Fig.2 Changes of urea and EC of fermented grains from complex aroma type liquor in the fermentation

比較清香型、濃香型與兼香型三種不同香型白酒，具有如下共同特點:一是出窖(出缸)時，EC濃度在110～130μg/kg，但尿素濃度在 26～80mg/kg。有研究表明，黃酒中尿素含量約在 20～30mg/L［20－21］，高的可達35mg/L［22］;二是EC的增長或下降與尿素的變化基本同步，推測白酒中EC的形成可能是尿素途徑，而不同于同是糧食蒸餾酒的威士忌－氰化物途徑。

成品黃酒中 EC 含量 116～205μg/L［23］，白酒中EC 濃度在 78～120μg/L(折算成 40%vol)［17］，這一數值低于黃酒中EC濃度。黃酒中EC主要是黃酒發酵結束后煎酒與黃酒貯存老熟階段產生的。研究發現在黃酒生產用水和糖化液中未檢測到EC，米酒、發酵液、煎酒液和成品黃酒中平均含量在8.2、7.9、21.6和52.7μg/kg［24］。從白酒酒醅中 EC 濃度看，這一數值比發酵結束后黃酒中7.9μg/L(發酵液)要高得多。推測這可能與白酒多菌種發酵中菌系比黃酒豐富有關，也與白酒生產中使用小麥、豌豆等高蛋白質含量的原料有關。

2.4.4 兼香型酒醅配料與蒸餾前后EC與尿素的變化 配料后，由于加入高粱，酒醅中尿素與EC濃度均下降，分別下降25.37%和32.08%;蒸餾后，酒醅中尿素和EC濃度比配料后濃度低。蒸餾后，酒醅中尿素和EC濃度分別下降15.37%和13.57%。這主要是糧食的稀釋與蒸餾作用引起的。

圖3 兼香型酒醅配料、蒸餾前后EC變化Fig.3 Changes of urea and EC of fermented grains from complex aroma type liquor before and after mixed and distillation

3 結論

超聲萃取固體基質樣品，頂空固相微萃取技術(HS－SPME)結合氣相色譜－質譜(GC－MS)檢測白酒大曲和酒醅中氨基甲酸乙酯(EC)的方法是一種快速、準確、環境友好的方法，該分析方法線性范圍寬，線性關系良好，準確度、回收率較好。通過研究大曲和酒醅中EC和尿素的變化，發現酒醅發酵過程中EC的變化與尿素濃度變化基本同步。

［1］CS Ough.Ethyl carbamate in fermented beverages and foods.I.Naturally occurring ethylcarbamate［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1976，24(2):323－328.

［2］A Nettleship，PS Henshaw，HL Mayer.Induction of pulmonary tumors in mice with ethyl carbamate(urethane)［J］.Journal of the National Cancer Institute，1943，4:309－319.

［3］R Baan，K Straif，Y Grosse，et al.Carcinogenicity of alcoholic beverages［J］.Lancet Oncol，2007，8(4):292－293.

［4］ED Stefani，P Boffetta，H Deneo－Pellegrini，et al.The effect of smoking and drinking in oral and pharyngeal cancers:A casecontrol study in Uruguay［J］.Cancer Letters，2007，246(1):282－289.

［5］EFSA.Ethyl carbamate and hydrocyanic acid in food and beverages.Scientific opinion of the panel on contaminants［J］.The EFSA Journal，2007，551:1－44.

［6］R Battaglia，HBS Conacher，BD Page.Ethyl carbamate(urethane)in alcoholic beverages and foods:A review［J］.Food Additives ＆ Contaminats，1990，7(4):477－496.

［7］JV Weber，VI Sharypov.Ethyl carbamate in foods and beverages:A review［J］.Environmental Chemistry Letters，2009，7(3):233－247.

［8］DF Stevens，CS Ough.Ethyl carbamate formation:Reaction of urea and citrulline with ethanol in wine under low to nomal temperature conditions［J］.American Journal of Enology and Viticulture，1993，44(3):309－312.

［9］SNF Bruno，DS Vaitsman，CN Kunigamid，et al.Influence of the distillation processes from Rio de Janeiro in the ethyl carbamate formation in Brazilian sugar cane spirits［J］.Food Chemistry，2007，104(4):1345－1352.

［10］趙光鰲，劉吉泉.酒中致癌物氨基甲酸乙酯的研究［J］.食品與發酵工業，1988(5):70－72.

［11］袁身淑，劉楊岷，王林祥，等.飲料酒中氨基甲酸乙酯測定方法的研究［J］.無錫輕工業學院學報，1991，10(3):7－14.

［12］李鳳華，曹艷平，王錫寧.GC－MS法測定白酒中的氨基甲酸乙酯［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，19(5):1240－1241.

［13］劉紅麗，張榕杰，盧素格.酒中氨基甲酸乙酯的測定分析［J］.中國衛生工程學，2010，9(4):299－300.

［14］譚文淵，袁東，付大友，等.氣相色譜與質譜法(GC－MS)測定白酒中的氨基甲酸乙酯［J］.食品研究與開發，2010，31(10):139－141.

［15］馬婭萍，孫守成，鄧富全.用二維色譜技術直接定量測定白酒中氨基甲酸乙酯［J］.分析測試學報，1996，15(5):47－50.

［16］范文來，徐巖.白酒功能因子與品質安全問題［J］.釀酒科技，2012(3):17－22.

［17］史斌斌，徐巖，范文來.頂空固相微萃取(HS－SPME)和氣相色譜－質譜(GC－MS)聯用定量蒸餾酒中氨基甲酸乙酯［J］.食品工業科技，2012，33(14):60－63.

［18］AV Roy，JR Heiwig.Urea determination of biological fluids using diacetylmonoxime reaction，4040787［P］.1976－5－21.

［19］王元太.清香型白酒［M］.北京:中國輕工業出版社.

［20］邢江濤，鐘其頂，熊正河，等.高效液相色譜－熒光檢測器法測定黃酒中尿素含量［J］.釀酒科技，2011(3):104－106.

［21］王曉娟，傅力，李建飛，等.高效液相色譜測定黃酒中尿素的含量［J］.食品工業科技，2009，30(5):317－319.

［22］周建弟，丁關海，鄭志強.酸性脲酶分解黃酒中尿素特性的研究［J］.中國釀造，2006(11):45－46.

［23］陳小萍，林國斌，林升清，等.蒸餾酒和發酵酒中氨基甲酸乙酯的監測與危害控制［J］.海峽預防醫學雜志，2009，15(6):54－55.

［24］巫景銘，洪瑞澤，馬麗輝，等.黃酒生產中氨基甲酸乙酯的監測與控制［J］.釀酒，2011，38(3):64－67.