高保真泡青菜鹵微生物增殖培養條件的初步研究

賈 春，車振明，林洪斌，張 琦，廖 余

(西華大學生物工程學院，四川成都610039)

泡菜，味美、爽口、開胃、營養豐富且百吃不厭［1］，其生產加工主要采用傳統自然發酵，此發酵方式存在生產周期長、產品品質穩定性差、安全性難以控制等問題［2－3］，嚴重制約了泡菜工業的發展。為使我國泡菜產業達到工業化、現代化、標準化，國內已進行了很多關于接種發酵的研究。楊曉輝［4］篩選出四株產酸好的菌株，將其接種發酵白菜，風味以及產酸速度明顯優于自然發酵。余文華［5］等人研究了直投式菌劑在發酵不同泡菜品種時，泡菜各項理化指標的動態變化，認為直投式菌劑發酵有利于提高泡菜的品質和食用安全性。袁亞［6］等人研究認為植物乳桿菌和干酪乳桿菌混合發酵泡菜可明顯縮短發酵時間、提高泡菜品質、降低亞硝酸鹽含量。然而，泡菜發酵是由多種微生物共同作用而成，僅僅依靠單一菌種或復合菌種進行接種發酵，始終難以還原泡菜原有風味。基于此，本文通過改變和控制泡青菜鹵微生物培養溫度及培養基初始pH，對微生物菌群分布狀況進行調節，研究不同培養條件下泡青菜鹵微生物接種發酵泡菜過程中總酸、pH、氨基態氮、總糖和亞硝酸鹽含量的變化，間接的研究高保真泡青菜鹵微生物培養的最適pH和培養溫度，以期達到對產品質量、風味以及營養價值改善和提高的目的，增加經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

陳泡菜鹵 成都新繁食品有限公司;胡蘿卜、食鹽 市售;甲醛溶液、硫酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰醋酸，硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸 均為分析純，成都科龍化工試劑廠;蒽酮 分析純，上?；ぴ噭┎少徆迓摶S。

DHP－9052型電熱恒溫隔水式培養箱 上海益恒實驗儀器有限公司;LDZX－75KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;UV－2600型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司;SW－CJ－2F型雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;TDL－40B型臺式低速大容量離心機 湖南星科科學儀器有限公司;PHS－3C型酸度計 方舟科技有限公司;JJ－2型組織搗碎機 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;78－1型磁力加熱攪拌器 金壇市富華儀器有限公司;分析天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備［7］胡蘿卜汁培養基制備工藝:胡蘿卜→洗凈→去皮及根梢→稱重→切片→煮沸(料∶水=1∶4)100℃，5min→榨汁→離心(3000r/min，20min)→調 pH→121℃，15min滅菌備用。

1.2.2 菌種的制備

1.2.2.1 培養基起始pH對泡青菜鹵中微生物接種發酵泡菜的影響 將泡青菜鹵接種于pH分別為4、5、6、7、8的胡蘿卜汁培養基中，每100mL胡蘿卜汁接種8mL泡青菜鹵。在恒溫培養箱中培養20h后，混勻，取40mL培養液于離心管中，3000r/min離心20min，棄掉上清液，即得所需的菌種。

1.2.2.2 培養溫度對泡青菜鹵中微生物接種發酵泡菜的影響 將泡青菜鹵接種于一定pH的胡蘿卜汁培養基中，每100mL胡蘿卜汁接種8mL泡青菜鹵。分別在 15、20、25、30、35℃的恒溫培養箱中培養 20h后，混勻，取40mL培養液于離心管中，3000r/min離心20min，棄掉上清液，即得所需的菌種。

1.2.3 泡青菜發酵工藝流程 采用高鹽泡制(12.5%食鹽濃度)和低鹽發酵(7%食鹽濃度)相結合，按下面工藝進行泡菜的恒溫發酵。發酵溫度為25℃。其工藝流程如下:

1.2.4 操作要點 選用細嫩、無病蟲害的新鮮青菜為泡制原料，去掉黃葉、爛葉，并用清水洗凈泥沙，并將其切分，瀝干備用。首先將切分后的青菜在12.5%的食鹽水中泡制3d，利用高濃度食鹽水抑制或殺死殘留在青菜上的微生物，并使青菜脫水入味，然后將泡青菜取出瀝干，分裝入壇，接種并浸泡在7%的食鹽水中，25℃恒溫發酵。注意裝壇完成后，要用一定濃度的鹽水將壇蓋檐密封，保證泡菜壇內處于厭氧環境。

1.2.5 測定方法 泡青菜鹵pH測定:采用數字pH計，分別用pH為4.00、6.86、9.18的標準緩沖溶液校準;泡青菜總酸的測定:采用酸堿滴定法［8］，NaOH濃度為0.09419mol/L;泡青菜氨基態氮的測定:采用甲醛滴定法［9］;泡青菜總糖含量的測定:采用蒽酮比色法［9］;泡青菜亞硝酸鹽含量測定:采用分光光度法［10］。各項指標均為隔周測定，指標測定過程中嚴格保持泡菜發酵條件，避免不利影響。

2 結果與分析

2.1 不同起始pH對泡青菜鹵微生物接種發酵泡菜理化指標的影響

2.1.1 泡菜總酸含量和泡菜鹵pH的動態變化 泡青菜鹵微生物培養基起始pH分別為4、5、6、7、8時，其接種發酵泡菜過程中總酸含量和泡菜鹵pH的動態變化如圖1～圖2所示。

圖1 培養基起始pH與泡菜總酸含量的關系Fig.1 The relationship between pickle total acid content and initial pH of medium

圖2 培養基起始pH與泡菜鹵pH的關系Fig.2 The relationship between pickle－brine pH and initial pH of medium

由圖1、圖2可知，不同培養基起始pH條件下培養的泡青菜鹵微生物接種發酵的泡菜在發酵過程中總酸含量均呈現逐漸升高的趨勢，在發酵第二周時，漸趨平衡。第四周時，培養基起始pH為7時的泡菜總酸含量持續上升而未達到平衡，有可能是因為該條件下培養的泡青菜鹵中有害微生物繁殖過多，導致其接種發酵的泡菜在發酵貯藏后期變質而產生這一現象。發酵第2周時，總酸含量從高到低依次為培養基起始pH4、8、5、6、7。各泡菜鹵 pH 逐漸降低，同樣在第二周達到穩定，pH從高到低依次為培養基起始 pH6、7、8、5、4，此時泡菜發酵成熟，因此后面各指標的判定皆以發酵第二周的數據為依據。泡菜發酵初期的乳酸生成量不高，泡菜的總酸含量和泡菜鹵pH變化幅度較小。隨著乳酸的積累，泡菜進入發酵旺盛期。此階段總酸含量迅速上升，泡菜鹵pH降低速度較快，一直持續到第二周，總酸含量達3.5～5.0g/kg，泡菜酸味強烈。此后，隨著總酸含量持續積累而進入發酵末期，此階段泡菜的總酸含量緩慢增長，泡菜鹵pH變化趨于平衡。

2.1.2 泡菜氨基態氮含量的動態變化 泡青菜鹵菌種培養基起始 pH 分別為4、5、6、7、8時，其接種發酵泡菜過程中氨基態氮含量的動態變化如圖3所示。

由圖3可知，不同培養基起始pH條件下培養的微生物接種發酵的泡菜氨基態氮含量變化趨勢基本一致(pH8除外)，均隨著發酵時間的延長而先降低后升高。這是因為在泡菜發酵過程中，青菜中的蛋白質會被泡菜中微生物分泌的蛋白酶作用而不斷降解成多肽、氨基酸等，這類物質會不斷地溶入泡菜鹵中，并被微生物利用，因此泡菜中氨基態氮含量逐漸降低［11］。但是當起始pH為8時，發酵第三周后氨基態氮含量的變化趨勢則與其他四組相反。可能在泡菜發酵成熟后泡菜水中的氨基態氮會通過滲透作用進入泡菜［11］，而該條件下的這種現象出現較早所致。發酵第二周時，泡菜中氨基態氮含量從高到低依次為培養基起始 pH7、5、6、8、4。

圖3 培養基起始pH與泡菜氨基酸態氮含量的關系Fig.3 The relationship between pickle amino nitrogen and initial pH of medium

2.1.3 泡菜總糖含量的動態變化 泡青菜鹵微生物培養基起始 pH 分別為4、5、6、7、8時，其接種發酵泡菜過程中總糖含量的動態變化，如圖4所示。

圖4 培養基起始pH與泡菜總糖含量的關系Fig.4 The relationship between pickle total sugar and initial pH of medium

由圖4可知，不同培養基起始pH條件下培養的微生物接種發酵的泡菜中總糖含量變化趨勢基本一致，均隨著發酵時間的延長而先降低后升高再降低。

這是因為，在泡菜發酵過程中，青菜中的糖類物質作為碳源被微生物分解利用，因此泡菜中總糖含量降低［11］。發酵第二周時，泡菜中總糖含量從高到低依次為培養基起始 pH4、7、6、5、8。

2.1.4 泡菜亞硝酸鹽含量的動態變化 泡青菜鹵微生物培養基起始pH分別為4、5、6、7、8時，其接種發酵泡菜過程中亞硝酸鹽含量的動態變化，如圖5所示。

圖5 培養基起始pH與泡菜亞硝酸鹽含量的關系Fig.5 The relationship between pickle nirite and initial pH of medium

由圖5可知，不同培養基起始pH條件下泡菜中亞硝酸鹽含量均呈降低的趨勢。這是因為在泡菜發酵過程中，蔬菜表面以及鹵水中有害微生物中硝酸還原酶將本來存在于蔬菜中的硝酸鹽還原，因而亞硝酸鹽含量增加。隨著發酵的進行，泡菜中乳酸菌產酸使得pH降低，抑制了有害微生物硝酸還原酶的活性，使得亞硝酸鹽含量降低。但是在泡菜發酵貯藏后期，培養基起始pH為4、7、8時的泡菜有可能因有害微生物的繁殖導致泡菜變質，亞硝酸鹽含量升高。發酵第二周時，泡菜中亞硝酸鹽含量從高到低依次為培養基起始 pH7、8、5、6、4。

2.2 不同培養溫度對泡青菜微生物接種發酵泡菜理化指標的影響

2.2.1 泡菜總酸含量和泡菜鹵pH的動態變化 泡青菜鹵微生物培養溫度分別為 15、20、25、30、35℃時，其接種發酵泡青菜過程中總酸含量和泡菜鹵pH的動態變化如圖6～圖7所示。

圖6 泡青菜鹵微生物培養溫度與泡菜總酸含量的關系Fig.6 The relationship between pickle total acid content and incubation temperature

圖7 泡青菜鹵微生物培養溫度與泡菜鹵pH的關系Fig.7 The relationship between pickle－brine pH and incubation temperature

由圖6～圖7可知，各溫度下培養的泡青菜鹵微生物接種發酵的泡菜在發酵過程中總酸含量均呈現逐漸升高的趨勢，在發酵第二周時，逐漸趨于平衡，總酸含量從高到低依次為培養溫度25、30、15、35、20℃。同時，各泡菜鹵pH則逐漸降低，同樣在第二周達到穩定，各條件下pH基本相同。

2.2.2 泡菜氨基態氮含量的動態變化 泡青菜鹵微生物培養溫度分別為 15、20、25、30、35℃時，其接種發酵泡菜過程中氨基態氮含量的動態變化如圖8所示。

由圖8可知，各溫度下培養的微生物接種發酵的泡菜氨基態氮含量變化趨勢基本一致，均隨著發酵時間的延長而先升高后降低。當培養溫度為20、30℃時，青菜中的蛋白質可被較快分解而使發酵過程中氨基態氮含量較其他幾組穩定。發酵第二周時，泡菜中氨基態氮含量從高到低依次為培養溫度25、30、15、20、35℃。

圖8 泡青菜鹵微生物培養溫度與泡菜氨基態氮含量的關系Fig.8 The relationship between pickle amino nitrogen and incubation temperature

2.2.3 泡菜總糖含量的動態變化 青菜鹵微生物培養溫度分別為 15、20、25、30、35℃ 時，其接種發酵泡菜過程中總糖含量的動態變化如圖9所示。

圖9 泡青菜鹵微生物培養溫度與泡菜總糖含量的關系Fig.9 The relationship between pickle total sugar and incubation temperature

由圖9可知，各溫度下培養的微生物接種發酵的泡菜中總糖含量變化差別較大，其中當培養溫度為25、30℃時，泡菜總糖含量基本保持穩定，而其他條件下泡菜總糖含量則有較大波動。發酵第二周時，泡菜中總糖含量從高到低依次為培養溫度15、25、30、35、20℃。

2.2.4 泡菜亞硝酸鹽含量的動態變化 泡青菜鹵微生物培養溫度分別為 15、20、25、30、35℃時，其接種發酵泡菜過程中亞硝酸鹽含量的動態變化如圖10所示。

圖10 泡青菜鹵微生物培養溫度與泡菜亞硝酸鹽含量的關系Fig.10 The relationship between pickle nitrite and incubation temperature

由圖10可知，泡菜中亞硝酸鹽含量先增加后降低，其動態變化存在“亞硝峰”，其中當泡青菜鹵中微生物培養溫度為15、25、35℃時的“亞硝峰”出現在第二周左右;當泡青菜鹵中微生物培養溫度為20℃時的“亞硝峰”出現時間較早，約在第一周即出現;泡青菜鹵中微生物培養溫度為30℃時的“亞硝峰”出現時間稍晚，大概在第三周左右出現。發酵第二周時，泡菜中亞硝酸鹽含量從高到低依次為培養溫度35、15、20、25、30℃。

3 結論

泡菜是蔬菜發酵制品的重要組成部分，隨著我國食品發酵行業的不斷發展，新型泡菜研制工藝是必趨之勢，秉承現代生物技術在食品加工業的應用先例，由單一菌種接種發酵轉向高保真菌種接種發酵新型泡菜加工技術的研究必將為發酵食品加工業翻開新的篇章。

本文通過研究不同培養基起始pH、培養溫度對泡青菜鹵微生物接種發酵泡菜過程中總酸、pH、氨基態氮、總糖和亞硝酸鹽含量的影響，間接的研究高保真泡青菜鹵微生物培養的最適pH和培養溫度，結果表明:當培養基起始pH為5～6、泡青菜鹵中微生物培養溫度為20～25℃時，可提高泡青菜總酸含量、氨基態氮含量，降低泡青菜鹵pH、總糖及亞硝酸鹽含量。但是，本文僅限于對泡青菜發酵過程中的各理化指標進行測定，該成果雖然對新型發酵工藝的研制有一定的理論意義，但是培養基起始pH及培養溫度對泡青菜鹵微生物培養過程中微生物菌系之間的調節作用;接種發酵的泡菜中微生物分布狀況;各條件下培養的泡青菜鹵微生物對于接種發酵泡菜理化指標變化情況影響的原因等問題還需要進一步深入的研究和探討。

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