雙表達重組腺病毒介導的骨形態發生蛋白2－9復合納米羥基磷灰石／聚酰胺66融合器用于山羊椎間融合的效果評價

馬金梁，黃 帆，汪 洋，羅進勇，鄧忠良

（1.重慶醫科大學附屬第二醫院骨科，重慶400010；2.重慶醫科大學分子醫學實驗室，重慶400016）

雙表達重組腺病毒介導的骨形態發生蛋白2－9復合納米羥基磷灰石／聚酰胺66融合器用于山羊椎間融合的效果評價

馬金梁1，黃 帆1，汪 洋1，羅進勇2，鄧忠良1

（1.重慶醫科大學附屬第二醫院骨科，重慶400010；2.重慶醫科大學分子醫學實驗室，重慶400016）

目的：比較雙表達重組腺病毒介導的骨形態發生蛋白2－9（Adv－BMP2－9）與單表達Adv－BMP9和Adv－BMP2復合納米羥基磷灰石／聚酰胺66（n HA／PA66）融合器用于山羊椎間融合的效果，驗證BMP2與BMP9的協同成骨作用。方法：選用40只中國青山羊行L2－3、L3－4和L4－5腰椎間融合術，共融合120個腰椎間隙。每個腰椎間隙植入n HA／PA66融合器復合以下4種腺病毒之一，Adv－BMP9（Adv－BMP9組，n＝30）、Adv－BMP2（Adv－BMP2組，n＝30）、Adv－BMP2－9（Adv－BMP2－9組，n＝30）和 Adv－GFP（Adv－GFP組，n＝30）。術后24周處死所有山羊，取出融合節段標本，行影像學評估和生物力學分析。結果：X線檢測，術前、術后各組間椎間隙高度（DSH）比較差異無統計學意義（P＞0.05）；各組標本椎間融合率，Adv－BMP2－9組為70%（21／30），Adv－BMP9組為53%（16／30），Adv－BMP2組為43%（13／30），而 Adv－GFP組為30%（9／30）。各組椎間CT融合度評分，Adv－hBMP2－9組、Adv－hBMP9組、Adv－hBMP2組和 Adv－GFP組依次為52.29±0.72、44.02±0.67、38.83±0.86和28.65±0.47，各組間比較差異均具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。生物力學評估，Adv－BMP2－9組融合節段剛度大于Adv－BMP9組（P＜0.05）；Adv－BMP9組融合節段剛度大于Adv－BMP2組，但差異無統計意義（P＞0.05）。實驗期間各組山羊均未觀察到局部或遠處感染、發熱和異物排斥反應。結論：雙表達Adv－BMP2－9復合n HA／PA66融合器對山羊椎間融合效果優于單表達 Adv－BMP9或Adv－BMP2，BMP2與BMP9具有協同成骨作用。

骨形態發生蛋白；重組腺病毒；椎間融合；納米羥基磷灰石；聚酰胺

骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）屬于轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）超家族的成員之一。BMP不僅有促進成骨功能，而且具有促進軟骨細胞的成骨、血管發生和脂肪細胞分化等多種生物學功能［1－3］。目前發現的具有誘導成骨分化的BMP主要有BMP2、4、6、7和9，其中重組人骨形態生成蛋白（rhBMP）2、7已經在臨床用于骨折延遲愈合、骨折骨不連、骨缺損和脊柱融合術的治療，并 取 得 了 一 定 的 治 療 效 果［4－5］。 然 而 rh BMP2、rhBMP 7的價格昂貴，在修復成骨的同時也存在成脂現象［6］，成骨能力不理想導致的手術失敗率也較高，因此尋找具有更強成骨能力的因子或者因子的組合十分迫切。對重組腺病毒介導的骨形態發生蛋白（Adv－BMP）2、4、6、7和9的研究［7］顯示：人肌肉成纖維細胞瘤細胞C2C12、小鼠間充質干細胞系C3H10細胞和裸鼠皮下注射的體外和體內實驗中，BMP9誘導成骨能力遠強于BMP2和BMP7。 關 于 Adv－BMP2、 Adv－BMP4、Adv－BMP6、Adv－BMP7 和 Adv－BMP9 的 研 究 顯示：BMP9和BMP2的協同成骨作用最強，但是該結果的準確性受到BMP2和BMP9腺病毒用量以及滴度測定準確性的影響。為了使BMP2和BMP9達到1∶1表達，避免基因表達的相互干擾，準確地研究BMP2和BMP9之間的協同作用及其促進成骨作用，本研究采用雙表達BMP2－9的重組腺病毒載體［8］，復合納米羥基磷灰石聚酰胺66融合器應用于山羊椎間，對其融合效果進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 選擇40只雌性中國本地青山羊，1～2歲，體質量（30.00±2.08）kg，由重慶醫科大學動物實驗中心提供。動物合格證號：SYXK（渝）2002007。實驗過程中對動物處置符合動物倫理學要求［9］。根據所選40只山羊腰椎L2～L5節段的平均椎間高度（disc space height，DSH），設計實驗用納米羥基磷灰石／聚酰胺66椎間（n－HA／PA66） 融 合 器。 腺 病 毒 BMP2－9、BMP9和BMP2由美國芝加哥大學分子腫瘤研究室提供，重慶醫科大學分子醫學實驗室保存。

1.2 動物分組及給藥 40只成年雌性山羊，行L2－3、L3－4和 L4－5腰椎融合術。每只山羊3個腰椎間隙分別被植入n HA－PA66融合器復合以下4種腺病 毒 的 3 種： Adv－BMP2－9、 Adv－BMP2、Adv－BMP9和 Adv－GFP。按植入物不同分為 Adv－BMP2－9組（n＝30）、Adv－BMP9 組（n＝30）、Adv－BMP2（n＝30）和Adv－GFP組（n＝30）。所有動物麻醉成功后取右側臥位，拍腰椎側位X線片。取左側腎型切口，切口起自羊左肋緣下3.0 cm、 距 后 中 線 約 10.0 cm， 止 于 髂 棘 上3.0 cm，切口長約11.0 cm。定位確定L2－3、L3－4和L4－5椎間盤。取同側自體髂骨大小約10 mm×10 mm×8 mm，均分成3份剪碎，分別加入等量等 滴 度（1×109IU·m L－1，0.5 m L）的 Adv－BMP2－9、Adv－BMP9、Adv－BMP2和 Adv－GFP中的3種，充分混勻后分別填至3個n HA－PA66融合器內，壓實備用。分別切除 L2－3、L3－4、和L4－5椎間盤，刮除終板軟骨至出血，保留前縱韌帶。隨機取n HA－PA66融合器分別植入3個椎間隙。于術后第2天開始，每天分2次臀部肌肉注射青霉素鈉320萬單位，共3 d。第2、4和6天消毒手術切口。觀察各組山羊腰部外觀，肢體活動、進食和傷口愈合情況。

1.3 影像學分析山羊椎間融合率和融合度評分術后即刻和每4周攝羊腰椎X線正側位片，在X線片上測量各手術節段的DSH（圖1），計算各組DSH平均值。X線融合率分析標準：0級，無新骨形成；1級，植入物和椎骨間可見到少量骨小梁；2級，植入物和椎骨間可見明顯的骨長入，但融合不明顯；3級，植入物和椎骨完全融合。所有山羊在第24周處死后取出融合節段標本，行螺旋CT掃描，在植入椎間融合器節段處取5個矢狀切面，每1 mm 1個層面，每個層面又分為與椎體相接的1、2和3三個區域（圖2）進行融合度評分。評分標準：0分，無新生骨的形成；1分，可見新生骨的形成，但椎體與植入物間無骨性連接；2分，椎體與植入物間已形成骨性連接。

圖1 腰椎DSH值測量示意圖Fig.1 Schematic diagram of measurement of DSH of lumbar vertebra

1.4 山羊椎體力學性能測試 術后24周處死所有山羊，取其中5只山羊腰椎標本，24 h內進行無破壞生物力學測試：取完整的山羊L2～L5椎體標本，剔除腰部肌肉，保留完整骨骼及韌帶，用骨水泥將標本兩端與上下實驗盤固定，用Instron力學測試機進行前屈、后伸、側屈和旋轉4個模式加載［10］。下位椎體固定，一個2 N·m最大力矩加于上位椎體，生物力學強度由載荷－位移曲線初始部分決定并計算。生物力學強度檢測指標選用剛度值，單位為牛·米／度（N·m／°）。比較4組山羊腰椎標本融合后的剛度。1.5 統計學分析 應用SPSS 12.0統計軟件對數據進行分析。各組標本CT層面融合度評分、不同運動狀態下平均剛度以±s表示，組間比較采用t檢驗。

圖2 融合度CT評分分區示意圖Fig.2 Partition schematic diagram of CT fusion score

2 結 果

2.1 山羊一般情況 實驗過程中有1只山羊術后第2天死亡，以另一只代替。所有動物均無脊髓損傷，術后可以正常飲食，傷口正常愈合。

2.2 各組山羊椎體融合影像學評價 各組融合節段X線片DSH測量，術前和術后各組山羊平均DSH比較差異無統計學意義。X線融合率分析，術后24周時，Adv－BMP2－9組山羊所有椎間隙21個椎間發生了融合（3級），余9個椎間可見明顯的骨長入（2級），融合度為70%（21／30）；Adv－BMP9組山羊術后24周16個椎間融合（3級），融合度為53%（16／30）；Adv－BMP2組山羊13個椎間融合（3級），融合度為43%（13／30）；Adv－GFP組山羊。僅9個椎間發生融合，18個椎間可見明顯的骨長入，但融合不明顯（2級），2個椎間發生了假關節形成（1級），1只發現融合器已脫出，但未脫落，融合度30%（9／30）。所有融合器均未見椎間融合器下沉和碎裂。Adv－BMP2－9組山羊椎體融合率明顯高于 Adv－BMP9組和 Adv－BMP2組（P＜0.05）。融合度CT分析，術后24周 時，Adv－BMP2－9組山羊椎間已完全融合（圖3A）；Adv－BMP9組山羊所有CT層面均可見植骨塊與椎體之間已形成骨性連接（圖3B）；Adv－BMP2組山羊椎體所有CT層面均可見新生骨形成，2、3區域的植骨塊與椎體之間有骨性連接（圖3C）；Adv－GFP組山羊椎體僅3區域的植骨塊與椎體之間有骨性連接（圖3D）。

各組山羊椎體術后24周時融合度評分：Adv－BMP2－9、Adv－BMP9、 Adv－BMP2 和 Adv－GFP組依次為52.29±0.72、44.02±0.67、38.83±0.86和28.65±0.47，組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

圖3 各組山羊標本椎間融合度CT評分Fig.3 CT fusion score specimens of goats in various groups

2.3 4組標本不同運動狀態下平均剛度Adv－BMP2－9、Adv－BMP9、 Adv－BMP2 和 Adv－GFP組標本融合節段剛度呈遞減趨勢；Adv－BMP9、Adv－BMP2組間剛度比較差異無統計學意義（P＞0.05）；Adv－BMP2－9組標本的融合節段剛度大于Adv－BMP9組和Adv－BMP2組，組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05）；Adv－BMP2組標本剛度大于Adv－GFP組，組間比較差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 術后24周各組標本不同運動狀態下平均剛度Tab.1 Average stiffness of specimens at different motion state 24 weeks after operation in various groups（n＝30±s，N·m／°）

表1 術后24周各組標本不同運動狀態下平均剛度Tab.1 Average stiffness of specimens at different motion state 24 weeks after operation in various groups（n＝30±s，N·m／°）

＊P＜0.05 vs Adv－BMP2－9 group；△P＜0.05 vs Adv－BMP9 group.

Group Average stiffness Fexion Extension Torsion Bending Adv－BMP2－9 5.6±0.35 5.2±0.34 6.6±0.42 6.5±0.39 Adv－BMP9 5.1±0.29＊ 4.7±0.32＊ 6.1±0.31＊ 5.9±0.44＊Adv－BMP2 5.0±0.27＊ 4.5±0.29＊ 6.0±0.51＊ 5.7±0.45＊Adv－GFP 4.5±0.36＊△ 4.1±0.41＊△ 5.3±0.39＊△ 5.0±0.22＊△

3 討 論

BMP是目前研究的熱點，其被認為是成骨能力最強、最具有臨床運用前景的成骨因子，但是現在臨床使用的骨形成誘導因子BMP2、7價格昂貴，治療效果不穩定。近來研究［11］顯示：BMP9具有異位成骨能力。本課題組前期研究［12］結果顯示：BMP9成骨能力較BMP2和BMP7強；BMP9和其他的BMP具有協同成骨的能力，特別與BMP2的協同成骨能力最強［7］。

山羊動物模型是脊柱融合較常用的模型，因為山羊脊柱的生物力學承重軸是脊柱的縱軸，其生物力學特點與人很相似。研究［13－14］表明：山羊頸椎的解剖、力學特點和骨密度植入與人體非常相似。Kandziora等［15］研究顯示：山羊 的 C2－3、C3－4節 段的生物力學特性與人體頸椎最為相似，適合進行生物力學測試。本研究采用山羊腰椎融合模型進行實驗，并以L2～L5節段作為融合節段。

本研究結果顯示：術前和術后4組山羊椎體融合節段DSH差異無統計學意義。術后24周時，Adv－BMP2－9組山羊椎體融合節段的融合率分別較Adv－BMP9組、Adv－BMP2組高。生物力學測定被認為是衡量椎間融合效果的另一個重要客觀指標。上述測試結果表明：術后24周Adv－BMP2－9組山羊椎體平均剛度大于Adv－BMP9組，差異有統計學意義；而Adv－BMP9組山羊椎體平均剛度高于Adv－BMP2組，但差異無統計學意義。4組標本中，Adv－GFP組標本融合節段平均剛度最低，與Adv－BMP2組比較差異有統計學意義。影像學及生物力學檢測結果顯示：術后24周，Adv－BMP2－9組與其余3組標本在組織融合度和力學穩定性方面的比較差異均有統計學意義，說明Adv－BMP2－9組標本達到了良好的融合效果。

本實驗中Adv－BMP9組山羊椎間融合率高于Adv－BMP2組，說明Adv－BMP9對椎骨缺損修復效果優于 Adv－BMP2，同盧小娟等［12］的研究結論一致，因此Adv－BMP9是更強的成骨誘導因子。而本實驗中Adv－BMP2－9組山羊椎體椎間融合率高 于 Adv－BMP9 和 Adv－BMP2 組， 說 明Adv－BMP2與Adv－BMP9具有協同作用，具體機理尚不明確。Adv－BMP2－9有望為骨腫瘤、骨折愈合和脊柱融合等多種骨骼疾病的基因治療提供一個作用強且安全和有效的平臺。

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Evaluation on effects of bone morphoge netic protein2－9 mediated by co－expressing recombinant adenovirus combined with nano－hydroxyapatite／polyamide 66 cage on lumbar interbody fusion of goats

MA Jin－liang1，HUANG Fan1，WANG Yang1，LUO Jin－yong2，DENG Zhong－liang1
（1.Departments of Orthopedics，Second Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China；2.Molecular Medicine Laboratory，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Objective To compare the interbody fusion effects of bone morphogenetic protein 2－9（Adv－BMP 2－9）with single expression of Adv－BMP9 or adv－BMP2 mediated by co－expressing recombinant adenovirus combined with nano－hydroxyapatite／polyamide 66（n HA／PA66）cage on lumbar interbody fusion of goats，and to clarify the collaborative osteogenesis effects of BMP2 and BMP9.Methods Interbody fusion was performed at L2－3，L3－4and L4－5in 40 Chinese green goats，included a total of 120 interspace of lumbar vertebrae.Each interspace of lumbar vertebra was randomly implanted with a n HA／PA66 cage combined with one of the following four adenovirus，Adv－BMP9（Adv－BMP9 group，n＝30），Adv－BMP2（Adv－BMP2 group，n＝30），Adv－BMP2－9（Adv－BMP2－9 group，n＝30），and Adv－GFP（Adv－GFP group，n＝30）.The goats were euthanized 24 weeks after operation，and the fusion segment speciments were obtained；radiographic inspection and biomechanical analysis were performed on the segment speciments.Results The X－ray results showed there was no significant difference of disc space height（DSH）before and after operation between various groups.The interbody fusion rates were 70%（21／30）in Adv－BMP2－9 group and 53%（16／30）in Adv－BMP9 group and 31%（5／16）in Adv－BMP2 group and 30%（9／30）in Adv－GFP group.CT fusion degree tests showed that CT fusion scores in Adv－hBMP2－9 group，Adv－h BMP9 group，Adv－hBMP2 group and Adv－GFP group were 52.29±0.72，44.02±0.67，38.83±0.86，and 28.65±0.47，respectively；there were significant differences between various groups（P ＜0.05 or P ＜0.01）.Biomechanical analysis showed that the stiffness of the fusion segment in Adv－BMP2－9 group was higher than that in Adv－BMP9 group（P＜0.05），and stiffness in the fusion segment in Adv－BMP9 group was higher than that in Adv－BMP2 group，but there was no significant difference（P＞0.05）.During the experiment，no local or distant infection，fever，and foreign body rejection were observed in all goats.Conclusion The interbody fusion effect of co－expressing Adv－BMP2－9 combined with n HA／PA66 cage is superior to Adv－BMP9 or Adv－BMP2 on goat lumbar，and BMP2 and BMP9 have collaborative osteogenesis.

bone morphogenetic protein；recombinant adenovirus；interbody fusion；nano－hydroxyapatite；polyamide

R681.5

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1086－05

2012－03－03

國家 “863”計劃資助課題（2008AA02Z443）；重慶市衛生局科研基金資助課題（2011－1－053）

馬金梁（1978－），男，湖北省荊州市人，講師，醫學博士，主要從事脊柱微創外科方面的研究。

鄧忠良（Tel：023－63693138，E－mail：deng7586＠gmail.com）