α－突觸核蛋白功能片段對原代培養大鼠神經元突起的促生長作用

王 鵬，許 潔，李 昕，于 順，何 欣

（1.北華大學基礎醫學院人體解剖學教研室，吉林 吉林132013；2.吉林化工學院理學院，吉林 吉林132022；3.首都醫科大學宣武醫院 北京老年病研究所神經生物學研究室，北京100053）

α－突觸核蛋白功能片段對原代培養大鼠神經元突起的促生長作用

王 鵬1，許 潔2，李 昕3，于 順3，何 欣1

（1.北華大學基礎醫學院人體解剖學教研室，吉林 吉林132013；2.吉林化工學院理學院，吉林 吉林132022；3.首都醫科大學宣武醫院 北京老年病研究所神經生物學研究室，北京100053）

目的：研究人α－突觸核蛋白（α－Syn）對原代培養大鼠神經元突起的促生長作用，闡明該蛋白質的功能片段，并探討其作用機制。方法：獲取新生Wistar大鼠大腦皮層神經元分組培養，分別加入α－Syn（添加α－Syn組）、α－Syn功能片段N端（添加N端組）、C端（添加C端組）和NAC段（添加NAC段組），對照組不添加功能片段。倒置相差顯微鏡觀察各組神經元突起的長度，Western blotting法、免疫熒光法特異性鑒定各組α－Syn蛋白的表達水平。結果：在生長至1和2 h，添加C端組和α－Syn組的神經元突起平均長度長于對照組（P＜0.05），而添加NAC段組和N端組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；生長至4 h，添加α－Syn組和C端組的神經元突起平均長度明顯長于對照組（P＜0.01），而添加NAC段組和N端組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。Western blotting和免疫熒光法檢測，N端和C端可以進入神經元，NAC段不能進入神經元。結論：α－Syn在原代神經元生長初期對其突起生長具有促進作用，具有這一功能的片段位于C端，其機制可能是其通過胞膜進入到神經元內，促進微管蛋白聚合形成微管，加速細胞骨架的形成和軸漿轉運。

突觸核蛋白；神經元；突起生長；細胞培養；帕金森病

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是臨床常見的神經系統退行性疾病，臨床表現呈進展性，目前尚無控制病程發展的有效措施。PD的病理特征為黑質多巴胺能神經元發生變性壞死和路易小體及路易軸索的形成［1－2］。多項研究［3］表明：人α－突觸核蛋白（α－Synuclein，α－Syn）是參與形成路易小體和路易軸索的主要成分。已知α－Syn與細胞的信號轉導有關，參與突觸形成、維持和神經元的分化，對突觸可塑性起一定作用。在PD病理中，α－Syn除了作為路易小體和路易軸索的主要成分存在于細胞間以外，尚存活多巴胺能神經元的胞體和軸突中也有分布，特別是在軸突中分布較胞體更為密集。α－Syn是1種具有140個氨基酸的蛋白質［4－6］。正常情況下，α－Syn空間構象不穩定，但與其他蛋白質作用后會形成比較穩定的構象。α－Syn功能片段包括：NAC段（第61～95位氨基酸），已被確定是α－Syn淀粉樣變和纖維化過程重要片段；N端（第1～60位氨基酸），對微管形成無作用，含有2個PD突變位點（30和53）；C端（第96～140位氨基酸），包含α－Syn有家族特征性信息，可促進微管蛋白在體外合成微管［7］。研究［8］發現：α－Syn與微管蛋白之間存在分子伴侶關系；α－Syn在體外實驗中能夠促進微管蛋白的聚合，加速微管的形成。有研究［9－10］顯示：α－Syn可以調節突起發出并促進原代培養大鼠神經元突起生長。但國內外尚無α－Syn各功能片段對突起生長影響的報道。本研究分離大鼠大腦皮層神經元，進行分組培養，觀察α－Syn各片段對神經元突起生長的影響，旨在確定具有促生長作用的片段，探討其作用機制和PD的發病機制。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑 新生24 h Wistar大鼠30只，雌雄不限，購自解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號：SCXK－（軍）2002－001。BCA蛋白質定量試劑盒（BCA Protein Assay Kit）購自PIERCE Biotech公司；α－Syn單克隆抗體3D5和各片段的單克隆抗體由宣武醫院神經生物研究室制備；FITC標記的羊抗鼠抗體購自中衫公司；細胞培養基DMEM（F－12）購自Gibco公司；胎牛血清（FBS）和馬血清（HS）購自HyClone公司；蛋白相對分子質量標準購自Pharmacia公司；其他試劑均為化學分析純試劑。

1.2 蛋白的純化與定量 實驗所用重組蛋白人α－Syn、N端（1～60）、NAC（61～95）和 C端（96～140）均采用親和層析法進行純化。采用SDSPAGE法進行鑒定，BCA法進行定量。

1.3 原代神經元培養 將Kohn創建的原代培養方法［11－12］進行改良。新生24 h大鼠斷頭，分離鼠腦，置于D－Hank’s緩沖液中，剝去大鼠血管腦膜，分離皮層，剪碎。胰酶消化45 min后吹散，篩網過濾。600 r·min－1離心3 min后棄上清，細胞沉淀用DMEM培養基懸浮，計數細胞密度。按每皿0.75×105個接種于培養皿中，加入相應蛋白進行分組培養。

1.4 神經元突起生長的觀察和長度測量 培養至第1、2和4 h時，向培養皿中添加1%戊二醛。室溫下固定1 h。隨機挑選30個視野進行拍照，要求每個視野至少有5個存活的神經元。鏡下觀察神經元形態。應用Image－Pro Plus V2.0軟件測量神經元突起的長度。

1.5 Western blotting法和免疫熒光法鑒定各組蛋白表達水平 吸棄培養皿中的培養基，沖洗。刮下細胞，超聲破碎。功率200 W，破碎30 s、2次，間歇 30 s。破 碎 后 加 入 SDS－PAGE Running Buffer，沸水中煮5 min。4°C、12000 r·min－1離心20 min，轉移上清液。取上清液30μL作為樣品，進行SDS－PAGE。電泳結束后，轉膜，脫脂奶溶液封閉，沖洗后，以1∶1000比例稀釋的相應抗體反應過夜。洗膜，再與1∶5000稀釋的生物素標記的羊抗鼠抗體溶液反應。沖洗后，ECL法顯示條帶。將培養細胞以1%戊二醛室溫下固定1 h后，PBS沖洗培養皿。以含10%羊血清的PBST溶液室溫封閉1 h。棄封閉液，加入1∶5000稀釋的3D5抗體1.5 m L。4°C過夜，用PBST沖洗。加入1∶500稀釋的FITC標記羊抗鼠抗體，37°C、2 h；吸棄反應液，PBST沖洗。熒光顯微鏡下觀察照相。

1.6 神經元分組培養 向原代神經元培養基中添加α－Syn、N 端、NAC 段 和 C 端，至 濃 度 為20 mol·L－1。培養至第1、2和4 h進行觀察。同時用未添加蛋白的正常生長組的神經元作為對照組，觀察各組神經元突起生長情況。

1.7 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析。各組神經元突起的生長長度以±s表示，組間比較用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組蛋白純化鑒定 經親和層析法純化，以BCA法鑒定得到純度較高的α－Syn、NAC段、N端和C端。見圖1。

圖1 純化后蛋白的SDS－PAGE電泳圖Fig.1 SDS－PAGE electrophoregram of purified proteins

2.2 各組神經元突起長度 在培養基內添加α－Syn和其他蛋白進行分組培養后，培養至1和2 h時添加α－Syn組和C端組的神經元突起平均長度大于對照組，添加N端組、NAC段組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。培養至4 h時，添加α－Syn組和添加C端組神經元突起長度明顯大于對照組（P＜0.01），而添加N端組、NAC段組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。添加C端具有與添加α－Syn相似的促突起生長功能，而添加NAC段和N端無促突起生長功能。見表1和圖2。

表1 各組神經元突起生長長度Tab.1 Lengths of neurites of neurons in various groups（±s，l／μm）

表1 各組神經元突起生長長度Tab.1 Lengths of neurites of neurons in various groups（±s，l／μm）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.

Group Length of neurite（t／h）1 2 4 Control 22.31±1.2629.56±2.0338.12±3.62 Addingα－Syn 29.67±2.54＊43.24±3.67＊62.31±3.85＊＊Adding N segment 22.62±3.1030.07±3.0237.09±2.72 Adding NAC 23.53±2.1129.27±3.5639.14±4.01 Adding C－Segment 28.46±1.73＊42.16±2.68＊61.22±3.96＊＊

2.3 各組α－Syn蛋白表達水平 添加α－Syn組神經細胞裂解液經Western blotting檢測，可見清晰條帶，α－Syn蛋白表達陽性；添加N端組和C端組為弱陽性；對照組、添加NAC段組未見條帶，α－Syn蛋白表達陰性。免疫熒光實驗，添加α－Syn組、C端組和N端組神經元顯色清晰，在細胞內呈廣泛、均勻分布，添加C端組和對照組為陰性。見圖3和4（插頁二）。

3 討 論

微管是中空管狀結構，在胞質中形成網絡結構［13］。微管廣泛存在于各種細胞中，對細胞有明顯的支持和定形作用，被認為是主要的 “細胞骨骼”。在神經細胞的軸突和樹突中，微管束沿長軸排列，起支撐作用。在胚胎發育階段，微管幫助軸突生長，突入周圍組織；在成熟的軸突中，微管是物質運輸的路軌，參與神經遞質的傳遞。神經元生長的特點之一是突起（軸突和樹突）自身缺乏合成蛋白的能力，其再生所需的結構和功能物質由胞體合成后經過長距離的轉運到達軸突末梢，而擔任此重要功能的物質之一即是微管，同時軸突的形成和徑向生長也與微管密切相關。外源性α－Syn以某種尚未明確的方式進入到原代培養的神經元內［9］，其能夠與微管蛋白結合，促進微管蛋白聚合形成微管，既可以穩定突起形態，又能夠加速軸漿轉運，從而可以使神經元突起生長加速。這一作用提示該蛋白很可能參與神經系統早期發育階段神經元突起的形成和中樞神經系統損傷后的修復。α－Syn的變異體A53T和A30P不具備微管有序組裝功能，對突起生長無影響。本文作者認為：在家族PD患者的腦神經元受到某種致病因子損傷后，由于伴侶蛋白的突變，影響微管的合成和有序排列，致使神經元突起修復和重建障礙或軸漿轉運紊亂，導致無定 形物的合成，這是PD發病原因之一。

圖2 鏡下各組神經元突起的生長長度（×40）Fig.2 Lengths of neurites of neurons in various groups under microscope（×40）

圖3 Western blotting法檢測α－Syn蛋白表達Fig.3 The expressions of α－Syn proteins detected by Western blotting method

Alim等［7］發現：α－Syn與微管蛋白在結構上存在著伴侶關系；體外實驗證實：微管蛋白對α－Syn纖維化聚合有啟動和促進作用；α－Syn和微管蛋白共同分布在PD患者的病灶區域。Alim等［8］發現：α－Syn可以促進微管蛋白聚合組裝成微管，并證實這一功能片斷在α－Syn的C末端。這些發現也支持了本實驗的結果。本研究結果顯示：α－Syn可以進入神經元細胞，促進原代培養神經元突起的生長，其作用片段位于C端。整個α－Syn分子含有7個KTKEGV不完全重復序列，該序列能夠介導α－Syn通 過細 胞 膜［14－15］。其 N 端 含 有 4 個 重 復 的KTKEGV殘基，且含有極性的螺旋，能與載脂蛋白結合，進入神經元內部，引起Western blotting和免疫熒光印跡的陽性反應；但添加N端并沒有促進突起生長的功能。而添加NAC段則不能進入細胞內，不能在突起內部促進微管骨架的合成，也不具有促突起生長的功能。失去穿梭能力可能是NAC成為PD患者腦組織間淀粉樣變性的主要原因。α－Syn與微管蛋白之間的共同作用關系目前已成為PD病因的研究熱點。

［1］Forno LS.Neuropathology of Parkinson’s disease［J］.Neuropathol Exp Neurol，1996，55（3）：259－272.

［2］Spillantini MG，Crowther RA，Jakes R，et al.alpha－Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with lewy bodies［J］.Proc Nat Acad Sci USA，1998，95（11）：6469－6473.

［3］Zarranz JJ，Alegre J，Gomez－Esteban JC，et al.The new mutation E46K of alpha－synuclein causes Parkinson and Lewy body dementia［J］.Ann Neurol，2004，55（2）：164－173.

［4］Maroteaux L，Campanelli JT，Scheller RH.Synuclein：a neuronspecific protein localized to the nucleus and presynaptic nerve terminal［J］.Neuroscience，1988，8（8）：2804－2815.

［5］Polymeropoulos MH，Higgins JJ，Golbe LI，et al.Mapping of a gene for Parkinson’s disease to chromosome q21－q23［J］.Science，1996，274（5290）：1197－1199.

［6］Kruger R，Muller T，Riess O.Involvement of alphasynuclein in Parkinson’s disease and other neurodegenerative disorders［J］.Neural Transm，2000，107（1）：31－40.

［7］Alim MA，Qiu LM，Kazuya T.Demonstration of a role for synuclein as a functional microtubule－associated protein［J］.J Alzheimer’s Dis，2004，6（4）：435－442.

［8］Alim MA，Hossain MS，Arima K.Tubulin seeds synuclein fibril formation［J］.J Biol chem，2002（277）：2112－2117.

［9］劉光偉，王 鵬，李堯華，等.α－突觸核蛋白促進大鼠原代培養神經元突起生長［J］.首都醫科大學學報，2009，30（5）：607－610.

［10］Lee HJ，Lee K，Im H.alpha－Synuclein modulates neurite outgrowth by interacting with SPTBN1［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，424（3）：497－502.

［11］Kohn JY.Quantitative determination of glutamate－mediated cortical neuronal injury in cell by lactate dehydrogenase efflux assay［J］.J Neurosci Methods，1987，20（1）：82.

［12］鄧小云，楊 眉，蔡 芳，等.一種改進的原代神經元的制備方法［J］.激光生物學報，2005，4（2）：145－149.

［13］Meloni MA，Galleri G，Camboni MG.Modeled microgravity affects motility and cytoskeletal structures［J］.Gravit Physiol，2004，11（2）：197－198.

［14］Bussell R Jr，Eliezer D.A structural and functional role for 11－mer repeats in alpha－synuclein and other exchangeable lipid binding proteins［J］.J Mol Biol，2003，329（4）：763－778.

［15］Keun JA，Seung RP，Kwang CC，et al. Amino acid sequence motifs and mechanistic features of the membrane translocation of α－synuclein［J］.J Neurochem，2006，97（1）：265－279.

Growth－promoting effect ofα－Synuclein function fragment on neurites of primary cultured neurons of rats

WANG Peng1，XU Jie2，LI Xin3，YU Shun3，HE Xin1
（1.Department of Human Anatomy，School of Basic Medical Sciences，Beihua University，Jilin 132013，China；2.College of Science，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China；3.Research Room of Neurobiology，Beijing Institute of Geriatrics，Xuanwu Hospital，Capital University of Medical Sciences，Beijing 100053，China）

Objective To study the growth－promoting effect ofα－Synuclein（α－Syn）function fragment on neurites of primary cultured neurons of rats and to clarify its physiological function fragment and to explore its mechanism.Methods The neurons in neocortex of newborn SD rats were cultured in various groups.Theα－syn（addingα－Syn group）and its function segments such as N segment（adding N segment group），C segment（adding C segment group）and NAC segment（adding NAC segment group）were added into the neural cells，and no protein was added into control group.The lengths of neurites of neurons were observed with inverted phase contrast microscope.Western blotting and immunofluorescence staining assay were used to confirm the expression levels of proteins in various groups.Results 1 and 2 h after culture，the average lengths of neurites in adding C segment group and addingα－Syn group were longer than that in control group（P＜0.05）；the average lengths of neuites in adding NAC and N segment groups had no significant differences compared with control group（P＞0.05）.4 h after culture，the average length of neurites in adding C segment group was significantly higher than that in control group（P＜0.01）；the average lengths of neuites in adding NAC and N segment groups had no significant difference compared with control group（P＞0.05）.The results of Western blotting and immunofluorescence staining assay showed that N segment and C segment could enter into the neuron，but NAC could not enter into the neuron.Conclusion α－Syn can enhance the outgrowth of neurite of primarily cultured neuron.The C segment ofα－Syn has the potential to enhance neurite outgrowth，and its possible mechanism may be that C segment ofα－Syn can enter into the neuron，and polymerize tubulin into microtubule，and accelerate the formation of cytoskeleton and axoplasmic transporting.

α－Synuclein；neuron；neurite outgrowth；cell culture；Parkinson’s disease

R741

A

2012－06－07

吉林省教育廳 “十二五”科學技術研究項目資助課題（吉教科合字［2012］第137號）

王 鵬（1977－），男，吉林省吉林市人，講師，醫學碩士，主要從事人體解剖學基礎理論和老年病神經生物學研究。

何 欣（Tel：0432－64608003；E－mail：hexin8040＠163.com）

1671－587Ⅹ（2012）06－1101－05