人胰島素樣生長因子-1真核表達載體的構建及在神經干細胞中的表達*

人胰島素樣生長因子-1真核表達載體的構建及在神經干細胞中的表達*

朱登納1)，王 軍1)#，賈延劼2)，牛國輝1)，張博愛2)，吳值榮1)
1)鄭州大學第三附屬醫院河南省小兒腦癱康復治療中心鄭州450052 2)鄭州大學第一附屬醫院神經內科鄭州450052 #通訊作者，女，1963年7月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:小兒神經康復，E-mail:wj3028@163.com

人胰島素樣生長因子-1;基因轉染;人臍帶血;神經干細胞

目的:構建人胰島素樣生長因子-1(IGF-1)真核表達載體，并在人臍血神經干細胞(NSCs)中表達。方法:采用RT-PCR法從人胎肝中克隆IGF-1基因，將其導入真核表達載體pcDNA3.1中，用脂質體轉染法將重組質粒轉染人臍血NSCs。分別采用RT-PCR和免疫熒光細胞化學法檢測轉基因NSCs中IGF-1 mRNA和蛋白的表達。結果:瓊脂糖電泳顯示RT-PCR擴增出462 bp的條帶;重組載體pcDNA3.1-IGF-1經HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后，得到5 428 bp和462 bp的兩個條帶;目的基因轉染的NSCs經RT-PCR擴增出一條與目的基因一致的條帶;免疫熒光細胞化學檢測到IGF-1蛋白的表達。結論:成功構建了人IGF-1基因的真核表達載體，轉染后IGF-1重組蛋白在人臍血NSCs中能成功表達。

神經干細胞(neural stem cells，NSCs)是指一類能夠自我更新并具有多向分化潛能(神經元細胞及膠質細胞)的未分化細胞群［1］。這種活躍的增殖狀態及多向分化潛能使得NSCs可作為修復神經系統損傷的理想材料［2］。胰島素樣生長因子1(insulin-likegrowth factor-1，IGF-1)在神經系統正常生長發育和成熟的全過程中發揮著重要作用［3］，同時體內外多種創傷模型也顯示了其重要的神經營養及神經保護作用［4］。既往研究［5-8］顯示，單獨進行NSCs移植或單獨應用IGF-1均對中樞神經系統損傷動物模型起到了良好的治療作用，促進了神經功能的恢復。而將二者結合，選擇IGF-1對NSCs進行基因修飾構造基因工程NSCs，將可能對中樞神經系統損傷的治療發揮更大的作用。為此作者構建了含有人IGF-1基因的重組質粒(pcDNA3.1-IGF-1)載體，并通過脂質體法轉染臍血NSCs，建立基因修飾NSCs(NSCs-IGF-1)，為中樞神經系統損傷的基因治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 Trizol、LipofectamineTM2000(美國 Invitrogen公司);瓊脂糖粉(北京Solarbio公司);RTPCR試劑盒、DMEM/F12培養基、DH5α(Gibco公司);BamHⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶、IGF-1抗體(Promega公司);免疫熒光試劑盒(FITC)、cDNA第一鏈的合成試劑盒、DNA Marker 15000(TaKaRa公司);膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒(美國OMEGA公司);DNA Marker D2000(北京天根生化科技有限公司);免疫組織化學試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);質粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-GFP、P3代臍血源性NSCs(河南省醫藥科學研究院神經免疫實驗室保存)。

1.2 重組質粒pcDNA3.1-IGF-1的構建 用Trizol試劑從人新鮮胎肝組織塊(胎肝來自鄭州大學第三附屬醫院4～5個月引產的胎兒肝臟，經產婦及家屬同意用于科學研究，簽署知情同意書，并經鄭州大學第三附屬醫院倫理委員會同意)中抽提總RNA，并將RNA逆轉錄成cDNA。根據GenBank公布的序列(NM_000618)，設計IGF-1(462 bp)引物為:上游引物5’-GACGGATCCATGGGAAAAATCAGCAGTCT TCCA-3’，下游引物5’-GACAAGCTTCTACATCCTG TAGTTCTTGTTTCC-3’。PCR反應體系:模板cDNA 2 μL，10 pmol/L上、下游引物各2 μL，2 mmol/L dNTP 4 μL，10×PCR buffer 5 μL，Taq酶1 μL，加入適量的雙蒸水，使總體積達50 μL。PCR反應條件: 98℃預變性5 min;98℃變性10 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環;最后72℃ 延伸7 min。反應結束后，取反應產物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察結果，凝膠成像儀拍照。切取目的基因片段進行純化回收，并將酶切片段按照目的基因片段∶質粒載體(pcDNA3.1)為10∶1的比例用T4DNA連接酶16℃連接過夜。將連接產物轉化感受態大腸桿菌，接種到氨芐青霉素抗性的LB平板培養過夜，次日挑取單個菌落接種到含有氨芐青霉素的培養基中搖菌擴增，提取質粒，用BamHⅠ與HindⅢ雙酶切鑒定質粒。對酶切正確的質粒送寶生物工程(大連)有限公司測序，并與公布的人IGF-1基因序列進行比對。大量提取質粒，保存備用。

1.3 重組質粒轉染臍血NSCs 按照文獻［9］的方法分離培養臍血NSCs，將傳至第3代的細胞以2× 105/孔接種于6孔培養板，孔內預先加有經多聚賴氨酸處理的蓋玻片，加入無血清DMEM/F12培養基37℃ 體積分數5%CO2條件下培養至對數生長期時，進行細胞轉染。將1 μg質粒DNA與2 μL脂質體分別用100 μL無血清無抗生素的DMEM/F12稀釋，混合后室溫放置30 min。棄去細胞培養液，用無血清無抗生素培養基DMEM/F12洗細胞2次，然后將上述質粒與脂質體混合物緩慢均勻加到細胞表面。37℃體積分數5%CO2條件下培養24 h后更換培養液繼續培養48 h后進行檢測。以攜帶綠色熒光蛋白的質粒pcDNA3.1-GFP對臍血NSCs進行轉染，檢測轉染率，隨后分為轉染空質粒pcDNA3.1 (對照組)及轉染質粒pcDNA3.1-IGF-1(實驗組)分別對NSCs進行轉染，以胎肝組織總RNA的PCR產物為陽性對照組。

1.4 轉IGF-1基因的NSCs檢測

1.4.1 IGF-1 mRNA表達的檢測 取基因轉染后48 h的NSCs采用Trizol試劑分別提取實驗組和空質粒對照組總RNA，分光光度計測總RNA的純度。cDNA第一鏈的合成和PCR過程分別采用反轉錄試劑盒和PCR試劑盒，按照說明書操作。

1.4.2 IGF-1蛋白表達的檢測 采用免疫熒光化學染色法。轉染后3 d用40 g/L多聚甲醛室溫固定細胞15 min，隨后用體積分數3%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，傾去血清，勿洗，在標本上滴加1∶100稀釋的小鼠抗人IGF-1抗體，4℃濕盒過夜，pH 7.4 PBS沖洗，每次5 min，共3次，加入FITC標記的羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1 h，水溶性封片劑封片后直接在熒光顯微鏡下觀察拍照。觀察時選用藍色激發光，陽性部位顯示綠色熒光。陰性對照組使用PBS代替一抗。

2 結果

2.1 IGF-1基因的克隆 胎肝組織總RNA的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示在462 bp處出現目的條帶，條帶清晰且無雜帶(圖1)。

2.2 重組質粒pcDNA3.1-IGF-1的鑒定 重組體pcDNA3.1-IGF-1經HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后，電泳結果示在5 428 bp處和462 bp處各有一條亮帶，與質粒載體及目的基因大小相符，證明所構建的真核表達質粒pcDNA3.1-IGF-1大小及方向正確?？召|粒組只在5 428 bp處有一條亮帶(圖2)。對酶切正確的質粒行測序鑒定，結果示目的基因與Gen-Bank IGF-1序列相符。

2.3 脂質體介導的NSCs的轉染率 熒光顯微鏡觀察轉染后綠色熒光蛋白的表達情況(圖3)，經計算得出脂質體介導的NSCs的轉染率為35.5%。

2.4 IGF-1基因在基因轉染NSCs中的表達 經RT-PCR檢測，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示:實驗組擴增出一條約462 bp條帶，與陽性對照組條帶相平齊，而轉染空質粒組無目的條帶的出現(圖4)。

2.5 IGF-1蛋白在轉基因IGF-1 NSCs中的表達轉染目的基因的NSCs行IGF-1免疫熒光化學染色，呈抗IGF-1陽性(圖5)。

3 討論

NSCs是基因治療神經功能損傷的理想種子細胞，以NSCs作為載體將外源基因移植到受損的神經系統具有其他載體細胞不可比擬的優勢:第一，攜帶基因的NSCs能夠與宿主中樞神經系統進行整合，通過與宿主神經元建立突觸聯系發揮其功能;第二，可提供所攜帶的靶基因表達的產物，進而達到基因治療的目的。

該實驗將細胞工程與基因治療相結合，把IGF-1基因成功轉染到載體細胞NSCs中，使IGF-1基因作為內源性的基因，由NSCs自身調控其合成、分泌。這樣既可避免局部用IGF-1治療時，由于有效成分被降解、稀釋及生理性屏障的作用，無法達到持續高效的濃度，又可避免在局部一次性大量注射藥物造成潛在的毒性，而通過細胞的調控作用可使組織達到安全有效的劑量。

該實驗中將重組體轉染NSCs，以建立基因修飾NSCs-IGF-1。目前常用的轉染方法有電穿孔法、顯微注射法、基因槍、磷酸鈣共沉淀法、病毒轉染法及脂質體轉染法等［10］。其中脂質體轉染法中所包含的磷脂是細胞生物膜的基本骨架，在目的基因導入細胞后，脂質體又可在胞質內被降解，因此該方法具有低毒、低免疫原性等優點，同時又由于無基因插入片段大小的限制，轉染率高，從而成為目前基因轉染最常用的方法之一［11］。該研究以新型陽離子脂質體LipofectamineTM2000為載體，進行質粒轉染，轉染率達35.5%。轉染NSCs經RT-PCR和免疫熒光化學染色示轉染后NSCs中可檢測到IGF-1 mRNA和蛋白的表達，證明基因轉染獲得成功。

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Construction of eukaryotic expression vector carrying human insulin-like growth factor-1 gene and expression in human neural stem cells

ZHU Dengna1)，WANG Jun1)，JIA Yanjie2)，NIU Guohui1)，ZHANG Bo’ai2)，WU Zhirong1)1)Rehabilitation and Treatment Center for Child Cerebral Palsy，the Third Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052 2)Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052

human insulin-like growth factor-1;gene transfection;human umbilical cord blood;neural stem cell

Aim:To construct eukaryotic expression vector for human insulin like growth factor-1(IGF-1)，and observe its expression in human umbilical cord blood(HUCB)neural stem cells(NSCs).Methods:IGF-1 was cloned from human fetal liver by RT-PCR and then inserted into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1.The recombinant plasmid pcDNA3.1-IGF-1 was transfected into HUCB NSCs with liposome-mediated method.IGF-1 mRNA and protein expressions in HUCB NSCs were detected by RT-PCR and immunocytochemistry，respectively.Results:A fragment of 462 bp was obtained by agarose electrophoresis after RT-PCR，and two fragments(5 428 bp and 462 bp)were obtained from the recombined plasmid after enzyme digestion.After transfection，a fragment that was consistent with the target gene was obtained，and the results of immunocytochemistry proved that there was expression of the transfected IGF-1 in HUCB NSCs.Conclusion:Eukaryotic expression vector containing IGF-1 has been successfully constructed.IGF-1 protein could be expressed in HUCB NSCs successfully.

R329.2

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.02.006

*河南省醫學科技攻關計劃基金資助項目 200703066

(2011-07-13收稿 責任編輯徐春燕)